【NGS原创系列二】DNA建库那些事儿

众所周知，⽬前市场上主要以⼆代测序为主，⼆代测序过程中第⼀步是⽂库构建，本期为⼤家介绍⼀下常见⽂库构建的种类。针对于illumina测序平台，DNA类的⽂库主要分为：DNA⼩⽚段⽂库、DNA⼤⽚段⽂库、Exon⽂库、PCR-Free⽂库和单细胞⽂库等。DNA⼩⽚段建库

DNA⼩⽚段⽂库是指⽚段⼤⼩在1kb以下的普通DNA⽂库（200bp、350bp、500bp等），DNA⼩⽚段⽂库可⽤来进⾏⼈重测序，动植物、微⽣物的de novo和重测序，16s rRNA测序，宏基因组测序等项⽬类型的⽂库构建。DNA⼩⽚段⽂库的构建主要包含以下2种⽅法：01

传统⽂库构建流程

传统建库流程主要分为以下⼏个步骤：

（1）将待测序的DNA分⼦⽤超声波打碎成200-500bp长的序列⽚段（2）将打碎后的基因组进⾏末端补平

（3）在补平后的⽚段3’端加A和5’端进⾏磷酸化（4）对修复后的⽚段进⾏接头连接（5）对接头连接后DNA⽚段进⾏PCR扩增（6）对扩增后的⽂库进⾏磁珠纯化DNA⼩⽚段⽂库建库原理图如下：

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转座法建库流程

转座法建库相对于传统建库，其实验⽅法简单快速，5分钟内即可同时完成DNA⽚段化和接头连接，⽽且所需要的DNA量少。⽬前市⾯上能提供具有⾃主知识产权专利的Tn5转座法建库试剂盒的公司就只有Illumina公司和TransGen公司。由于转座酶与所输⼊的基因组量有⼀定的⽐例关系，因此我司开发了2款转座酶法建库试剂盒：（1）针对50ng起始量DNA（2）针对1ng起始量DNA转座法建库原理图如下：

DNA⼤⽚段建库

DNA⼤⽚段⽂库，⼜称之为末端配对（mate-paired）⽂库，⽚段长度⼤于1kb，主要⽤于动植物，微⽣物的de novo测序。DNA⼤⽚段⽂库的构建主要分为以下⼏个步骤：（1）将待测序的基因组打断

（2）将打碎的基因组进⾏末端修复和进⾏Biotin标记（3）将标记好的基因组环化（4）将环化后的基因组打碎（5）磁珠捕获⽚段化的基因组

（6）对捕获后的基因组进⾏末端修复加A和加接头（7）对接头连接后的基因组进⾏PCR扩增（8）将PCR扩增后的⽂库进⾏分选回收DNA⼤⽚段⽂库建库流程图如下：

Exon⽂库

⼈类外显⼦组总共约30 Mb，占⼈类基因组约1%，外显⼦具有⾼度的保守型，且⼤部分疾病的致病位点位于外显⼦区。外显⼦测序是指利⽤序列捕获技术将外显⼦区域DNA捕捉并富集后进⾏⾼通量测序的基因组分析⽅法。Exon⽂库主要⽤于⼈全外显⼦测序和⽬标区域测序。外显⼦⽂库的构建流程主要分为以下⼏个步骤：

（1）将质量合格的基因组DNA超声打碎成200-300bp左右的⽚段（2）将打碎的基因组DNA⽚段进⾏末端修复，3’端加A和5’端进⾏磷酸化（3）对修复后的⽚段进⾏接头连接

（4）对接头连接后DNA⽚段进⾏线性扩增（LM-PCR）制备成杂交⽂库（5）将构建好的⽂库进⾏探针杂交捕获（6）将捕获后的⽂库进⾏PCR扩增富集

⼈全外显⼦测序与全基因组测序相⽐较，外显⼦测序具有测序覆盖度深，数据准确性⾼等优势，对于研究已知基因的SNP、Indel等具有较⼤的优势，因此主要应⽤在肿瘤基因测序⽅⾯。PCR-Free⽂库

PCR-Free⽂库，顾名思义，就是在⽂库构建过程中不需要进⾏PCR的⽂库。主要是针对⼀些特殊样本，⽐如GC含量⾼、PCR扩增困难的样本和PCR产物。不⾜之处在于所需的样本起始量较少。

PCR-Free⽂库的构建与传统⼩⽚段⽂库构建流程相⽐较，前⾯步骤相同，只是不需要进⾏PCR扩增富集。⽂库构建原理流程图如下：

单细胞DNA⽂库

随着⼆代测序技术的发展，把⼀次实验测许多条DNA序列的这个难题解决之后，⼀次把⼀个⼈的全基因组给测出来，最极限的情况，就是样本量少到⼀个细胞，就可以测出整个基因组的序列信息。同时也需要克服以下三个难题：（1）如何实现均匀扩增（2）全基因组覆盖问题（3）如何实现较⾼的扩增效率

为了解决上述的难题，科学家想了很多办法，到⽬前为⽌，⼤家⽐较认可的⽅法有2种：第⼀种是MALBAC⽅法，第⼆种是MDA⽅法。1

MALBAC⽅法

MALBAC⽅法，它的全称是：MultipleAnnealing and Looping-Based Amplification Cycles，是谢晓亮教授发明的⽅法，如下图所⽰：

上图中⿊⾊的线条，就是基因组模板DNA，这些红颜⾊的线条就是扩增引物，扩增引物的5’端有27个碱基的通⽤序列，这些通⽤序列会作为未来的PCR通⽤扩增引物的结合序列。扩增引物的3’端有8个随机序列的碱基，这8个碱基可以随机地杂交到基因组DNA的互补序列上。这些灰⾊的椭园是Phi 29 DNA聚合酶，Phi 29 DNA聚合酶有⼀个特点，它不仅可以⽣成新的DNA链，它还能把之前已经合成好的DNA链给解链开。再形成⾃⼰的新链，这个特点能够把每个循环所能合成的DNA新链的数量提⾼⼏倍、甚⾄⼏⼗倍、上百倍。接下来，就是做5个MALBAC循环，第⼀个循环得到的是 5’端有通⽤序列的DNA⽚段；第⼆个循环后，产⽣的扩增产物⼤部分是5’端有通⽤序列，3’端有与通⽤序列互补的序列⽚段。该⽅法在每个循环的最后，加了⼀步58度退⽕，这⼀退⽕过程让完整扩增的产物，它的两端发⽣链内杂交，这样3’端的序列就不能与新的、游离的引物发⽣杂交，也就不会引新的、发起始于3’端的扩增，就避免了完整扩整的产物的⾃我指数扩增。MALBAC⽅法设计的扩增引物有8个随机序列，这样就可以在模板上随机地找结合位置，因此所有的位点都有⼀样的机会被扩增。该⽅法扩增的产物分为3种：第⼀种，就是m* n 个“完整扩增产物”，即最主要的产物，这⾥“m”就是循环的次数，“n”是⼀个循环中，有多少个扩增，引物可以粘到⼀个模板上。第2种扩增产物，就是(m+1)* n个“半扩增产物”，第3种DNA，就是原始的DNA模板，这⾥完整产物的数量是“m*n”，也就是说，扩增产物（的数量）与扩增的循环次数“m”成正⽐，⽽不是与m的平⽅成正⽐，更不是与2 的M次⽅成正⽐，这就达到了我们想要的“线性扩增”的⽬的，即扩增产物（的数量）与扩增的次数成线性关系，进⽽实现了单细胞测序当中第⼀个要求“线性扩增”。第⼆个要解决的难题，就是“全基因组覆盖”问题，这⾥是利⽤Phi 29聚合酶⼀次在模板上能聚合出多个新链来达到这个⽬的。在5轮的扩增之后，每个模板都会有5*n^2个扩增⽚段，这样就可以保证建库时⼤多数的基因组区域可以被建成⽂库。 第三个要解决的问题“⾼效率扩增”，仍是利⽤了Phi 29酶⼀次能得到多个扩增⽚段来实现的。2

MDA⽅法

⽬前市场上还有⼀种单细胞扩增技术，叫MDA扩增技术，它的全称是Multiple Displacement Amplification。该⽅法的技术核⼼是利⽤Phi 29DNA聚合酶来进⾏直接的扩增。Phi 29酶的特点是，它可以把双链DNA进⾏解链，然后在常温条件下，就可以将原始模板进⾏⼤量扩增。原理如下图所⽰：

上述两种⽅法各有优劣。MDA⽅法的优势在于实验⽅法简单，且扩增效率更⾼。MALBAC⽅法的特点在于它的扩增均⼀性更好，但是扩增效率相对⽐较低。

⽬前单细胞测序技术的应⽤主要有以下⼏个⽅⾯：（1）体外受精胚胎测序

（2）CTC测序，找到突变位点，针对性地进⾏靶向药物治疗

（3）肿瘤亚细胞群测序，监测肿瘤细胞不断发⽣的新的突变，并找到对应的治疗⽅案

（4）免疫细胞测序，免疫细胞在对抗原发⽣识别后，其基因组发⽣重排并产⽣对抗原特异的抗体，测序可找出特异的基因结构以上为本期为您介绍的内容，希望对您的科研有所帮助，下期见！研发部 ⽩ 霞 ▏⽂案市场部 刘婷婷 ▏编辑

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