实时荧光定量PCR具体实验步骤

以下实验步骤仅供参考： 1 样品 RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞 . 室温放置 5 分钟使其完全溶解。

②两相分离 每 1ml 的 TRIZOL试剂裂解的样品中加入 0.2ml 的氯仿 . 盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后 .15 到 30℃孵育 2 到 3 分钟。4℃下 12000rpm离心 15 分钟。离心后混合

液体将分为下层的红色酚氯仿相 . 中间层以及无色水相上层。 RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 60%。

③ RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的 RNA混.匀后 15 到 30℃孵育 10 分钟后 . 于 4℃下 12000rpm 离心 10 分钟。此时离心

前不可见的 RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④ RNA清洗 移去上清液 . 每 1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少 1ml 的 75%乙 醇（ 75%乙醇用 DEPCH2O配制） . 清洗 RNA沉淀。混匀后 .4 ℃下 7000rpm离心 5 分 钟。

⑤ RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液 . 使 RNA沉淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。 ⑥溶解 RNA沉淀 溶解 RNA时 . 先加入无 RNA酶的水 40μl 用反复吹打几次 . 使其完全溶解 . 获得的 RNA溶液保存于 -80 ℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定

先用稀释用的 TE溶液将分光光度计调零。 然后取少量 RNA溶液用 TE稀释（ 1:100 ） 后 . 读取其在分光光度计 260nm和 280nm处的吸收值 . 测定 RNA溶液 浓度和纯度。 ① 浓度测定

A260下读值为 1 表示 40 μ g RNA/ml。样品 RNA浓度 ( μg/ml) 计算公式为： A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml 。具体计算如下：

RNA溶于 40 μl DEPC水中 . 取 5ul.1:100 稀释至 495μl 的 TE中 . 测得 A260 = 0.21 RNA 浓度 = 0.21 ×100 ×40 μ g/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/ μ l 取 5ul 用来测量以

后 . 剩余样品 RNA为 35 μ l. 剩余 RNA总量为： 35 μ l × 0.84 μg/ μl = 29.4 μg

②纯度检测

RNA溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA纯度 . 比值范围 1.8 到 2.1 。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g 琼脂糖溶于 72ml 水中 . 冷却至 60℃.10 ml 的 10× MOPS电泳缓冲液和 18 ml 的 37% 甲醛溶液 (12.3 M) 。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS.pH 7.0 0.1M 0.01M

乙酸钠 EDTA

TRIZOL 试剂的

实时荧光定量 PCR操作步骤

灌制凝胶板 . 预留加样孔至少可以加入 25 μ l 溶液。胶凝后取下梳子 . 将凝胶板放入电泳槽内 . 加足量的 1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备 RNA样品 取 3μgRNA.加 3 倍体积的甲醛上样染液 . 加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为

. .

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10μg/ml 。加热至 70℃孵育 15 分钟使样品变性。 ③电泳

上样前凝胶须预电泳 溴酚兰指示剂进胶至少

5min. 随后将样品加入上样孔。 5–6V/cm电压下 2h. 电泳至 2– 3cm。

④紫外透射光下观察并拍照

28S和 18S核糖体 RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA的物种类型）.上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带 . 它由低分子量的 RNA（tRNA和 5S 核糖体 RNA）组成。在 18S 和 28S 核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB染色物质 . 可能是由 mRNA和其它异型 RNA组成。RNA制备过程中如果出现 DNA污染 . 将会在 28S 核糖体 RNA带的上面出现 . 即更高分子量的弥散迁移物质或者带 .RNA 的降解表现为核糖体 RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 3 样品 cDNA合成 ①反应体系 序号 1 2 3 4 5 6 7 8

反应物 逆转录 buffer 上游引物 下游引物

剂量

2μl 0.2 μ l 0.2 μ l

dNTP 0.1 μl

逆转录酶 MMLV 0.5 μ l DEPC水5μl RNA模版 2μl 总体积10μ l

轻弹管底将溶液混合 .6000rpm 短暂离心。

②混合液在加入逆转录酶 MMLV之前先 70℃干浴 3 分钟 . 取出后立即冰水浴至管内外温度一致 . 然后加逆转录酶 0.5 μ l.37 ℃水浴 60 分钟。

③取出后立即 95℃干浴 3 分钟 . 得到逆转录终溶液即为 cDNA溶液 . 保存于 -80 ℃ 待用。 4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β -actin ）实时定量 PCR ①β -actin 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为 1011. 反应前取 3μl

109876

按 10 倍稀释（加水 27μl 并充分混匀）为 10. 依次稀释至 10、10、10、10、 10、10. 以备用。②反应体系如下：标准品反应体系 序号 1 2 3 4 5 6 7 8

反应物

剂量

10μ l 0.5 μl 0.5 μl

SYBR Green 1 染料 阳性模板上游引物 F 阳性模板下游引物 R dNTP

0.5 μl

Taq 酶 1μ l

阳性模板 DNA 5μ l ddH2O 总体积

32.5 μl 50μ l

5

4

. .

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轻弹管底将溶液混合 .6000rpm 短暂离心。 管家基因反应体系： 序号 1 2 3 4 5 6

7 8

反应物

剂量

10μl 0.5 μ l

0.5 μ l

SYBR Green 1 染料 内参照上游引物 F 内参照下游引物 R dNTP

0.5 μl

Taq 酶1μ l

待测样品 cDNA 5μl ddH2O 32.5 μl 总体积50μ l

轻弹管底将溶液混合 .6000rpm 短暂离心。③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机 . 反应条件为： 93℃ 2 分钟 . 然后 93℃ 1 分钟.55 ℃ 2 分钟 . 共 40 个循环。

5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA模板

①针对每一需要测量的基因 . 选择一确定表达该基因的 cDNA模板进行 PCR反应。 反应体系： 序号 1 2 3 4 5 6 7

反应物

剂量

2.5 ul 10× PCR缓冲液 MgCl2 溶液 上游引物 F 下游引物 R dNTP混合液 Taq 聚合酶 cDNA 1 ul

1.5 ul

0.5 ul 0.5 ul 3 ul 1 ul

8 25ul 加水至总体积为

轻弹管底将溶液混合 .6000rpm 短暂离心。

35 个 PCR循环（ 94℃1 分钟； 55℃1 分钟； 72℃1 分钟）； 72 o C延伸 5 分钟。 ② PCR产物与 DNA Ladder 在 2％琼脂糖凝胶电泳 . 溴化乙锭染色 . 检测 PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

③将 PCR产物进行 10 倍梯度稀释 : 将 PCR产物进行 10 倍梯度稀释 : 设定 PCR 产物浓度为 1×10. 依次稀释至 10、 10、 10、10、10、10 几个浓度梯度。 6 待测样品的待测基因实时定量 ①所有 cDNA样品分别配置实时定量

体系配置如下： 序号 1 2 3 4 5 6 7

反应物 上游引物 下游引物 dNTP Taq 聚合酶 ddH2O

剂量 1ul 1ul 1ul

2ul 30ul

SYBR Green 1 染料

PCR

PCR反应体系。

10

9

8

7

6

5

4

10 ul

待测样品 cDNA 5ul

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8 总体积 50 ul

. .

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轻弹管底将溶液混合 .6000rpm 短暂离心。

②将配制好的 PCR反应溶液置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR扩增反应。反应条件为： 93℃2 分钟预变性 . 然后按 93℃ 1 分钟.55 ℃1 分钟.72 ℃1 分钟. 共 40 做个循环 . 最后

72℃7 分钟延伸。

7 实时定量 PCR使用引物列表

引物设计软件： Primer Premier 5.0. 并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构； 引物不在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反

应 ( 即错配 ) 。 8 电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行 Realtime PCR 反应。 PCR 产物与 DNA Ladder 在 2％

试剂

?

SYBR Premix Ex Taq 18s rRNA NR2B

NR2B(+) NR2B(–) 18s rRNA(+) 18s rRNA(–)

1） 按下列组份配制 PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

TM

（2×）

μ M） μ M） .

使用量 12.5 μl 1 μl 1 μl

CGTTTATGGTCGGAACTACGA CCGCAGCACTATTGAGAACA ATCCATGTGTAGCCGTAGCC TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA

198 bp

组织 RNA提取：

一般认为 100mg肝组织提取 RNA 500ng.100mg肺提取 RNA 200ng.脑内的 RNA丰度适中 .100mg脑组织 . 提取 RNA 5-200ng。所以一个 10mg的海马可匀出 RNA约为20ng。 反转录反应

反转录反应参照 TaKaRa RT-PCR说明书。

反转录反应条件如下。

37°C 15 min （反转录反应）

85°C 5 sec （反转录酶的失活反应）

Real Time PCR 反应

选用脑源神经营养因子（ 为内参。 基因

引物序列

扩增片段长 度 213 bp

BDNF）为目标基因 . 核糖体 18S rRNA(18S rRNA)做

琼脂糖凝胶电泳 .GoldView ? 染色 . 检测 PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

实时荧光定量 PCR

终浓度 1×

PCR Forward Primer （10

PCR Reverse Primer （10 .

0.4 μM 0.4 μM

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模板（ cDNA溶液） dH2O Total

0.5 μl

10 μ l 25 μl

全班 40人 . 分为 5组 . 每组做 8管。4管做 BDNF.4管做 18S rRNA。4管BDNF或者 18S rRNA.采用相应的正反 PCR引物。每种基因做两个模板 . 一个模板采用原液浓度 . 一个模

板采用稀释一倍浓度 . 体积均为 0.5 μl 。 2）三步法 PCR

温度 95°C 58°C 72°C

时间 0 秒 15 秒 0 秒

时间 30 秒 30 秒 30 秒

变温速度 20°C/秒 20°C/秒 0.1 °C/秒

首先 95°C 作用 3 min 。 PCR 进行 35 个循环。 步骤 变性 退火 延伸 融解曲线 温度 95°C 55°C

95°C PCR疑难解答

当 PCR结果不甚满意时 . 首先检查以下几方面并遵照执行： 1 将 PCR反应的试管与反应板紧贴。

2 当酶反应混合物以 70℃“热启动”开始循环时 . 切记在加入酶后稍 3 微振荡一下 . 因为在 0.2-ml 的 PCR管中不能均匀传热。

4 不要随意减少 dNTP的用量 . 它是一个系统的因素 . 必须与其它成份保持平衡。 5 对于有问题的 PCR反应 . 例如模板的量少 . 模板不纯和环状模板等 . 先尝试加 Taq 酶前的体系进行预变性 . 后加模板进行正常 没有扩增产物：

1 在提供 MgCl2缓冲液中 . 以 0.25mmol/L 为梯度增加 MgCl2浓度；无 MgCl2 的缓冲液以 0.5 mmol/L 为梯度增加 MgCl2 浓度。

2 泳道中出现模糊条带 . 如果 DNA模板中存在 RNA.则按上述提示浓度补加 MgCl2. 因为在 PCR反应中可能缺少游离的 Mg2+。 3 检查退火温度和变性条件 . 如果有需要的话 . 可降低退火温度。 4 检查模板和引物的用量。

5 增加循环次数和 / 或模板 DNA的用量。泳道中出现模糊条带： 1 减少循环次数或模板

DNA的用量。

2 提高退火温度 . 但不要超过 68℃。

3 重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：

1 建议使用 0.2-ml 薄壁管。厚壁管在 92℃时不能有效地使模板变性。 .

.

PCR扩增。

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2 最佳反应体积为 50ml. 推荐用 30ml 矿物油覆盖（对盖子加热的 PCR仪可以不加）。 3 大多数反应中 .0.75ml （ 0.5~1ml ）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 4 建议 使用 1.75mmol/L MgCl2∶ 350mmol/L dNTP 或 2.25mmol/L MgCl2∶ 500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最佳结果 . 优化 Mg2+的浓度是必需的。 5 基因组 DNA模板的质量显著影响 PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA的长度。 DNA片段长度可以超过 50kb. 传统的基因组 DNA能扩增片段至 10kb。

6 要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的 作过程相关文献。

7 降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段 火温度来增加反应的特异性。这点非常重要 性短片段优先扩增的影响。 8 变性：第一步变性在

94℃下进行 2 分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间

（ 94℃下进行 20--30 秒） . 除非模板中富含 GC.则 95℃下变性 30 秒。这可以防止 DNA脱嘌啉和链断裂 . 对于所需扩增的基因组 DNA片段终长度超过 12 kb 时.应该尽可能的降低

变性温度。

9 延伸： 68--72 ℃下进行延伸操作。

10 循环延伸：尽量采用循环延伸的条件 . 若 PCR仪无此功能 . 则必须增加延伸的时间 . 例如在扩增 10kb 片断时 . 延伸时间用 10 分钟替代原来的 8 分钟。

11 长片断 PCR系统扩增的片断其 3’- 末端带有一个突出的 A. 因此建议采用 T/A 克隆。若要进行平端可隆 . 可用 Klenow 酶和 T4 DNA多聚酶将 PCR产物补平后再进行。

12 测序时因酶的混合物带有 3’→ 5’外切酶活性 . 用 Sanger 方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

13 在无菌的 0.5ml 或 0.2ml 离心管中按下列操作程序加样： 14 反应物 加样顺序 体积 ( μl) 去离子水 1 29.4 10×Buffer B 2 5 1

×

终浓度

PCR扩增时 . 引物长度

PCR反应的退

一般为 24~34 个核苷酸 . 溶点在 60~68℃间。使用这类引物可提高

DNA。请查阅高分子量

DNA提取操

. 长片段扩增的效果往往受到非特异

10×PCR Buffer 成分： Tris-HCl pH8.5 100 mM KCl500 mM MgCl15 mM

4×dNTP混合物 3 5 MgCl 4 3 1.5mmol/L

2

各 200μmol/L

有义引物 5 2.6 0.25 μmol/L

反义引物 6 2.6 0.25 μmol/L 模板 7 2 0.1 μ g

. .

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TaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit 2. 3. 4.

用微量可调加样器和一次性 Tip 向每一管中加 50μl 矿物油。每加一管换一次 Tip 。 振荡每只管 . 然后短暂离心。

将管放到预热的热循环中 . 按下列程序开始循环：

预变性94℃4分钟1次 变性 94℃ 1 分钟 退火 37-65 ℃ 1 分钟 延伸 72℃ 1 分钟 循环 30次

终延伸72℃7分钟1次 保存 4℃ 讨论

1. 假阴性 . 不出现扩增条带

PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备 . ②引物的质量与特异性 . ③酶的质量 . ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有 Taq 酶抑制剂 . ②在提取制备模板时丢失过多 . 或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。 在酶和引物质量好时 . 不出现扩增带 . 有可能是模板核酸提取过程出了

毛病 . 可使用阳性对照的 DNA模板配合检查模板质量。

酶失活：需更换新酶 . 或新旧两种酶同时使用 . 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称

. 是 PCR失败或扩

增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题 . 两条引物一条浓度高 . 一条浓度低 . 造成低效率的不对称扩增 . 对策为：①选定一个好的引物合成单位。 ②

引物的浓度不仅要看 OD值. 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电

泳 . 一定要有引物条带出现 . 而且两引物带的亮度应大体一致 . 如一条引物有条带 . 一条引物无条带 . 此时做 PCR有可能失败 . 应和引物合成单位协商解决。 如一条引物亮度高 . 一条亮度低 . 在稀释引物时要平衡其浓度。 ③引物应高浓度小量分装保存 . 防止多次冻融或长

期放冰箱冷藏 . 导致引物变质降解失效。 ④引物设计不合理 . 如引物长度不够 . 引物之间形成二聚体等。

2+ 2+

Mg 浓度： Mg 离子浓度对 PCR扩增效率影响很大 . 浓度过高可降低 PCR扩增的特异性 . 浓度过低则影响 PCR扩增产量甚至使 PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行 PCR扩增采用的体积为 20ul 、 30ul 、50ul 、或 100ul. 应用多大体积进行 PCR扩增 . 是根据科研和临床检测不同目的而设定 . 在做小体积如 20ul

后 . 再做大体积时 . 一定要模索条件 . 否则容易失败。

物理原因：变性对 PCR扩增来说相当重要 . 如变性温度低 . 变性时间短 . 极有可能出现假阴性 ; 退火温度过低 . 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率 . 退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计 . 检测一下 扩增仪或水

溶锅内的变性、退火和延伸温度 . 这也是 PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失 . 影响引物与模板特异性结合 . 或因靶序列

. .

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某段缺失使引物与模板失去互补序列

. 其 PCR扩增是不会成功的。

2. 假阳性

出现的 PCR扩增条带与目的靶序列条带一致

. 有时其条带更整齐 . 亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性 . 因而在进行PCR扩增 时. 扩增出的 PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短 . 容易出现假阳性。需重新设

计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染： 这种污染有两种原因： 一是整个基因组或大片段 的交叉污染 . 导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决： ①操作时应小心轻柔 . 防止将靶序列吸入加样内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外 . 所有试剂或器材均应高压消毒。 所用离心管及样进头等均应一次性使用。 ③必要

时 . 在加标本前 . 反应管和试剂用紫外线照射 . 以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染 . 这些小片段比靶序列短 . 但有一定的同源性。可互相拼接 . 与引物互补后 . 可扩

增出 PCR产物 . 而导致假阳性的产生 . 可用巢式 PCR方法来减轻或消除。 3. 出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致 . 或大或小 . 或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现 . 其原因：一是引物与靶序列不完

2+

全互补、或引物聚合形成二聚体。 二是 Mg 离子浓度过高、 退火温度过低 . 及 PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量 . 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现 . 酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必

要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量 . 适当增加模板量 . 减

少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法 (93 ℃变性 .65 ℃ 左右退火与延伸 ) 。 4. 出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差 .dNTP 浓度过高 .Mg浓度过高 . 退火温度过低 . 循环次数过多引起。其对策有： ①减少酶量 . 或调换另一来源的酶。 ②减少 dNTP的浓度。 ③适当降低 2+

Mg 浓度。④增加模板量 . 减少循环次数。

PCR技术类似于 DNA的天然复制过程 . 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA的变性：模板 DNA经加热至 93℃左右一定时间后 . 使模板 DNA双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA解离 . 使之成

为单链 . 以便它与引物结合 . 为下轮反应作准备；②模

板 DNA与引物的退火 ( 复性 ) ：模板 DNA经加热变性成单链后 . 温度降至 55℃左右 . 引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸： DNA模板 -- 引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下 . 以 dNTP为反应原料 . 靶序列为模板 . 按碱基配对与半保留复制原理 . 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性 -- 退火 -- 延伸三过程 . 就

可获得更多的 “半保留复制链” . 而且这种新链又可成

为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟 .2 ～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大

几百万倍。到达平台期 (Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

2+

. .

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PCR的三个反应步骤反复进行 . 使 DNA扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA扩增量可用 Y＝(1 ＋X)n 计算。Y 代表 DNA片段扩增后的拷贝数 .X 表示平 (Y) 均每次的扩增效率 .n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%.但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期 . 靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式 . 随着 PCR 产物的逐渐积累 . 被扩增的 DNA片段不再呈指

数增加 . 而进入线性增长期或静止

期 . 即出现“停滞效应” . 这种效应称平台期数、 PCR扩增效率及 DNA聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下 . 平台期的到来是不可避免的。

PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5’端之间 . 是需要扩增的特定片段。短产物片段和长

产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的 . 以一个原始模板为例 . 在第一个反应周期中 . 以两条互补的 DNA为模板 . 引物是从 3’端开始延伸 . 其 5’端是固定的 .3 ’端则没有固定的止点 . 长短不一 . 这就是“长产物片段”。进入第二周期后 . 引物除与原始模板结合外 . 还要同新合成的链 ( 即“长产物片段” ) 结合。引物在与新链结合时 . 由于新链模板的 5’端序列是固定的 . 这就等于这次延伸的片段 3’端被固定了止点 . 保证了新片

段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、

形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加 . 而“长产物片段” 则以算术倍数增加 . 几乎可以忽略不计 . 这使得 PCR的反应产物不需要再纯化 . 就

能保证足够纯 DNA片段供分析与检测用。

基因表达谱

基因表达谱 (gene expression profile)

：指通过构建处于某一特定状态下

的细胞或组织的非偏性 cDNA文库 , 大规模 cDNA测序 , 收集 cDNA序列片段、定性、定量分析其 mRNA群体组成 , 从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表 达种类和丰度信息 , 这样编制成的数据表就称为基因表达谱基因

表达谱的获得与表示

在基因芯片的实验中 . 首先选取来自不同状态的样本 . 如正常组织与肿瘤组织、不同发育阶段组织 . 或用药前后的细胞或组织等。 其中一种被称为实验样本 . 另一种就是相应地被称为参考样本。 实验样本和参考样本 mRNA在逆转录过程中 . 分别用不同的红、绿荧光基团

标记 . 并将它们混合 . 与微阵列上的探针序列进行杂

交 . 经过适当的洗脱步骤后 . 用激光扫描仪对芯片进行扫描 . 获得对应于每种荧光的荧光强度图像 . 通过专用的图像分析软件 . 可获得微阵列上每个点的红、 绿荧光强度（ Cy5 和

Cy3）. 其比值（ Cy5/Cy3）称为该基因在实验样本中的表达水平。

Step1：基因芯片的制备。在硅胶、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上按特定的排列方式固定大量的探针 . 形成 DNA芯片。芯片种类较多 . 制备方法也不尽相同 . 基本上可以分为

两大类：原位合成和直接点样法。

Step2：荧光标记探针的制备。将待分析的基因探针在芯片杂交之前进行纯

化、逆转录或扩增级荧光标记。最普遍的荧光标记法是用 Cye3-dUTP(绿色荧光 ) 标记对照样本 .Cye5-dUTP(红色荧光 ) 标记实验室样本。

Step3：标记探针与芯片杂交。 选择杂交条件 . 将制备的荧光探针与芯片进行杂交 . 一定时间以后 . 洗去未结合探针 . 然后进行荧光信号的扫描与分析。

Step4：杂交芯片的扫描。 杂交后的芯片用特定波长的激光进行激发 . 此时芯

. .

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片上的探针会发出不同波长的荧光。用共聚焦激光扫描仪检测探针的荧光强度 . 可以得到 Cy5 和 Cy3 的两幅单色图像。分别对这两幅图像进行伪色彩处理 . 然后叠加称为一幅图像 . 这就

是实验所得到的原始数据——杂交图像。图像中样点的

荧光强度值间接给出了基因芯片中对应探针的相对丰度值。 如果来自测试样本的表达丰度高 . 那么样点呈红色；如果来自参考细胞样本的表达丰度高 . 那么样点呈绿色；如果两者丰度相当 . 样点就呈黄色； 如果二者没有进行杂交反应 . 则样点保持背景黑色不变。通过这种方

法 . 取自两个不同样本的基因相对表达水平差异就可以表现出来。

Step5：将基因表达谱数据从杂交图像中提取出来 . 即将原始杂交图像转化为基因表达谱数据。

研究意义

肿瘤在组织形态学上被划分为多种不同的类型和亚型 . 而肿瘤亚型的准确诊断对肿瘤的临床治疗具有重要意义 . 然而肿瘤的分型在临床上一直处于难以处理的状态 . 许多形态学上

相似的肿瘤 . 如白血病的许多亚型等都会有相似的临床症

状 . 但却需要不同的治疗方法 . 从分子生物学的角度上看 . 肿瘤是由于某些染色体上 DNA损伤致使细胞内基因异常表达 . 导致细胞生长失控、缺乏分化和异常增

生的一类复杂基因疾病。正因为肿瘤发展机制的复杂性 .100 多年来的研究仍未揭开其中的奥秘。 研究肿瘤基因表达谱、 选取信息基因是从信息学角度出发以寻找肿瘤相关基因、 发现肿瘤基因表达特征的直接手段。 肿瘤基因表达谱数据显著特点是样本的位数高而样本很小、 噪声冗余大而信息基因少。 每个样本都记录了组织细胞中所有可测基因的表达水平 . 但实际上只有少数基因才真正同样本类别相关 . 它包含了样本分类的信息。信息基因选取问题是肿瘤基因表达谱分析的核心内容。它既是建立有效分类模型的关键 . 也是发现肿瘤分类与分型

的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的重要手段 . 目前人们对该问题已进行了一定程度的探 索。然而 . 如何在基因表达谱的成千上万个基因中有效选出样本的分类特征 . 一直是肿瘤基因表达谱分析中的难点所在 . 这个问题仍有待深入研究。

当前的肿瘤分类技术高度依赖病理学工作者对肿瘤组织的主观判断 . 而基于微阵列技术 . 即使一些组织没有显著变化 . 利用基因表达谱也能够对之做出早期

诊断；基于基于基因表达谱的肿瘤分型和分类研究为理解肿瘤的发生的机制 . 以及肿瘤的临床治疗提供了重要依据； 研究人员可以根据基因表达谱的变化来区分形态学上相似的肿瘤 . 而

肿瘤类型的精确诊断将有助于制定配套的最佳治疗方案。

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表达谱基因芯片实验操作流程 一、试剂 1. TRIzol

2. 异丙醇

3. 氯仿

4. 75%乙醇（ RNase-free ） 5. Milli-Q 水（ RNase-free ） 6. 无水乙醇 7. dNTPs

8. Cy5-dCTP和 Cy3-dCTP 9. 杂交试剂 1 10. 标记试剂 I 11. 杂交试剂 2 12. 标记试剂 II 13. 反转录酶 14. 标记试剂 III 15. 反转录引物 16. 洗片试剂 1 17. 反转录酶缓冲液 18. 洗片试剂 2 19. DTT 20.

洗片试剂 3

* 试剂 7～20 为产品芯片杂交试剂盒中的组分。二、仪器与设备 1.

电动玻璃匀浆机 2. 电子天平 3. 低温高速离心机 4. 低温高速台式离心机 5. 超净工作台 6. 机 7. 电热恒温水槽 8. 电泳槽 9. 电泳仪 10. 微波炉 11. 凝胶成像仪 12. 台式离心机 13. 核酸定量分析仪 14. 移液 15. 可调电炉 16. 旋涡混合器 17. 杂交箱 18. 杂交舱

19.

S-200 纯化柱

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20. 21.

真空浓缩仪 盖玻片

22. 芯片扫描仪 三、总 RNA提取

1) 将超低温保存的样品除去样品袋 . 在电子天平上称重后 . 转移至用液氮预冷的碾钵中 . 用杵子碾磨组织 . 其间不断加入液氮 . 直至碾磨成粉末状。

2) 将碾磨成粉末状的样品 . 转移至已经加入适量 TRIzol 试剂的匀浆管中 . 把匀浆管置于冰浴中 . 在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆至匀浆液不粘且无颗粒 即可。

3) 将匀浆液转移至 15ml 离心管中 . 于 4℃.12000g. 离心 10min。 4) 小心吸取上清液转入新的 15ml 离心管 . 在 15～ 30℃放置 5min。

5) 向匀浆液中加入氯仿 . 盖紧离心管盖 . 用力震荡离心管 . 在 15～30℃放置 3min。

6) 于 4℃.12000g. 离心 15min。

7) 从离心机中小心地取出离心管 . 吸取上清至另一 15ml 离心管。 8) 向上清加入异丙醇 . 轻轻颠倒离心管充分混匀液体. 在 15～ 30℃放置 10min。

9) 于 4℃.12000g. 离心 10min。

10) 弃去上清 . 缓慢地沿管壁加入 75%乙醇 5ml. 轻轻颠倒洗涤离心管管壁 . 小 心弃去乙醇。

11) 再加入 75%乙醇 10ml. 在涡旋器上短暂涡旋；于 淀 5min。

13) 加入 RNase-free 的 Milli-Q 水完全溶解 RNA沉淀后 .-80 ℃保存。四、探针标记与杂交 1、预杂交

1) 配制预杂交液：杂交试剂 1 加入到的 Eppenderf 管中 . 振荡混匀后 . 加入杂交试剂2混匀。

2) 将配制好的预杂交液放入 95℃水浴锅内变性 2min. 将待预杂交的玻片放 入 95℃水浴锅内变性 30sec. 玻片取出后即放入无水乙醇中 30sec. 晾干。

3) 将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内. 盖上盖玻片 . 放入杂交箱内 42℃预杂交 5～6hr 。

2、标记探针（以下在冰浴中进行）

1) 于一已灭菌的 1.5mlEppendorf 管内依次加入以下试剂 （反应终体积为 50μl. 以下试剂均为 RNase-free ）：

ddH2O 23μ l 逆转录引物 5μ l 总 RNA50～100μg

振荡混匀 . 置于 70℃水浴 10min。取出后 . 迅速置于冰上。 2) 分别加入以下试剂：逆转录酶缓冲液 10μl

4℃.8000g 离心 10min。

12) 小心弃上清 . 短暂离心 . 用移液吸去所有上清 . 在超净工作台中干燥沉

.

DTT5μl dNTPs4μl

3) 而后在暗室中加入以下试剂：

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逆转录酶 2μl

Cy5-dCTP或 Cy3-dCTP 3μl

4) 用手指弹打管壁以混匀样品 . 手浴 2min。将 Eppendorf 管置于 42℃水浴 2hr 。

5) 依次在 Eppendorf 管中加入标记试剂 I 4μ l.65 ℃水浴 10min 后加入标记试剂 II 4 μl 。混匀 . 合并对照组、实验组。避光 . 真空抽干至 50μl 左右。

6) 使用 DNA纯化柱（或乙醇沉淀）纯化 DNA。

7) 将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀 . 悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈 . 掰断柱下端的密封头。

8) 将柱置于一个 1.5ml 的 Eppendorf 管中 . 以 3000rpm离心 1min 将柱置于另一个新的 1.5ml Eppendorf 管中 . 去掉顶端的帽 . 将样品慢慢加到树脂上表面的中

间 . 注意不要搅动柱体。 以 3000rpm离心 2min. 经纯化的样品流出 . 被收集在支持用的 Eppendorf 管中。

9) 加入标记试剂 III 8 μl. 真空抽干。 3、杂交

1) 在抽干的探针管中加

6.5 μl 杂交试剂 I. 充分混匀 . 使探针溶解。再加入

6.5

μ l 杂交试剂 II. 混匀备用。

2) 将预杂交的玻片取出 . 用 ddH2O冲去盖玻片。

3) 将探针置于 95℃水浴中变性 2min；玻片置于 95℃水浴中变性 30sec. 玻片取出浸无水乙醇 30sec. 探针取出后迅速置于冰上。

4) 将探针置于芯片上 . 用盖玻片覆盖 . 置于杂交舱中 . 用 Parafilm 密封 . 放入42℃杂交箱内杂交过夜（ 16～18h）。 4、洗片

1) 用 0.5%的洗涤液 1 冲洗玻片 . 去除盖玻片。

2) 准备两个染色缸 . 分别装有 0.5%的洗片试剂 1+2%的洗片试剂 2、5%的洗片试剂 3. 放入 60℃水浴锅中。

3) 将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤 10min。 4) 用 0.5%的洗涤液 1 冲洗玻片 . 晾干后扫描。 基因芯片技术原理及其在表达谱中的应用

摘要：基因芯片（ Genechip ）. 又称 DNA芯片（ DNAchip ）或 cDNA微矩阵（ cDNA Micro array ）. 是利用光刻合成、 高速打印或电定位等技术在硅、 玻璃或尼龙膜上按照特定的排列方式固定有大量的基因探针（ Gene probe） . 形成 DNA微阵列。样品DNA/RNA通过 PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术摻入荧光标记分子与 DNA微阵列杂交后 . 通过荧光扫描器及计算机分析 . 即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。该技术可应用于高通量基因表达平行分析 . 大规模基因发现及基因分析 . 基因多态性分析和基因组研究等 , 特别在表达谱中

有重大应用价值。

关键词：基因芯片 . 微阵列 . 基因表达检测 .DNA测序 . 人类基因组计划

随着人类基因组计划的顺利进行 . 预计到 2003 年人类可以完全测出自身的基因组序列。届时 . 人类将进入后基因组时代。探明人类全部基因的结构及其表达将成为后基因组时代的一个重要目标 . 而进行基因表达的检测则是研究基因功能的一个重要环节。 传统的建立在电泳基础上的基因表达、 序列测定、突变和多态性检测等研究方法 . 如 PAGE、mRNADD和 RDA

等 . 不仅费时、 费力、费钱 . 且不利

. .

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于自动化；而 DNA芯片技术结合人类基因组计划提供的大量信息 . 使得我们能够在全部基因组水平上对上述问题进行研究 . 其精细度可达到单个细胞中的一个拷贝。因此有人说今后基

因组研究的大部分工作将在缩微芯片实验室 （Laboratory on a chip ）完成。

DNA芯片是生物芯片（ Biochip ）的一种。微阵列包括上万种寡核苷酸或

DNA样

品 . 密集排列在硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上。通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息 . 经电脑系统处理 . 分析所得资料。一次微排列实验可对上千种基因的表达水平、

突变和多态性进行快速、准确的检测。 1. DNA 芯片技术的基本原理

DNA芯片实质上就是在芯片上按照特定的排列方式固定上大量的探针 . 形成一种DNA微矩阵 . 将样品 DNA/RNA通过 PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子后 . 与位于芯片上的探针杂交 . 最后通过荧光扫描仪及计算机进行综合分析后 . 即可获得样品中大量基因序

列及表达的信息。其中制备芯片的材料通常是

硅片、玻片、或者是尼龙膜；探针可以是寡核苷酸或 1-1

基因芯片的制备

cDNA.视用途而定。

芯片种类较多 . 制备方法基本上可分为两大类：一类是原位合成；一种是直接点

样。原位合成 . 是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针；而直接点样 . 是指将已经合成好的探针定位在芯片上。 1-2 样品制备、杂交和检测

待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、 扩增及标记。 根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同 . 采用的基因分离、扩增及标记方法也各异。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记 . 目前采用的最普遍的荧光标记方法采用的荧光素种类更

多 . 这可以满足不同来源样品的平行分析。用

计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号

. 通过

计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。 杂交条件的选择与研究目的有 关。多态性分析或者基因测序时 . 每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。如果 芯片仅用于检测基因表达

. 只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸

. 更高的严谨性 . 更高的样品浓度和低温度

. 这

即可。表达检测需要长的杂交时间

有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测 . 要鉴别出单碱基错配 . 需

要更高的杂交严谨性和更短的时间。 宁可累死 在路上 ，也不 能闲死 在家里 ！宁可 去碰壁 牙， 是羊就 腿 么是奋 斗？奋 年越来斗就是每天很难，可一年一年却越来越容 易。不 奋斗就 是每天 都很容 易，可 一年一 越难。 能干的 人，不 在情绪 上计较，只在做事上认真；的人！不在做事上认真，只 ，也不在情绪 上计较 。是狼。拼一 就要练个春夏 好秋冬！ 赢一个 要练好无悔人 生。什！早 安！—————献给所有努力的人 能面壁

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