miRNA let-7a和miRNA let-7f早期诊断肝癌的临床价值

刘旭斌;余德奎;邹汉良;杨娟;陶绪雄;李杰

【摘 要】目的 探讨原发性肝癌患者miRNA let-7a、miRNA let-7f的表达.方法 收集龙岗中心医院院及合作医院2014年6月至2016年3月接受肝癌切除手术的40例原发性肝癌患者.采用RT-PCR方法检测miRNA let-7a、miRNA let-7f在血清、肝癌/癌旁组织中的表达水平.选择同期该院体检的40例健康者作为健康对照者.比较肝癌患者和健康对照者血清miRNA let-7a、let-7f的表达差异.结果 肝癌癌变组织miRNA let-7a[(0.18±0.04)×103]、miRNA let-7f[(0.19±0.01)×103]分别较癌旁组织[(1.52±0.11)×103、(0.67±0.10)×103]低,差异有统计学意义(P<0.01);肝癌患者血清miRNA let-7a[(0.22±0.06)×103]、miRNA let-7f[(0.15±0.04)×103]较健康对照者[(1.13±0.21)×103、(0.62±0.12)×103]低,差异有统计学意义(P<0.01).结论 miRNA let-7a、miRNA let-7f在肝癌患者病变组织及血清中异常偏低表达,可作为早期诊断肝癌的重要标志物,为临床诊断提供参考.%Objective To study the expression of miRNA let-7a and let-7f in primary liver cancer patients.Methods In our hospital from June 2014 to March 2016,40 patients with primary liver cancer were sellected.the expression levels of miRNA let-7a and let-7f in serum and liver

cancer/tumor adjacent tissues were detected by RT-PCR methods.A total of 40 healthy volunteers were selected at the same time and expression of miRNA let-7a,let-7f in serum were analyzed.Results The miRNA in cancer tissues [let-7a (0.18±0.04)×103,let-7f(0.19±0.01)×103]were lower than those in the adjacent tissues [let-7a(1.52±0.11)×103,let-7f(0.67±0.10)×103].The difference was statistically significant(P<0.01);In

primary liver cancer,the level of miRNA let-7a[(0.22±0.06)×103,let-7f(0.15±0.04)×103] were lower than those in normal healthy

people[(1.13±0.21)×103,(0.62±0.12)×103],the difference was statistically significant(P<0.01).Conclusion miRNAlet-7a,miRNA let-7f are abnormally low expression in the tissue and the serum of primary liver cancer patients. 【期刊名称】《检验医学与临床》 【年(卷),期】2017(014)014 【总页数】3页(P2017-2019)

【关键词】肝癌;miRNAlet-7a;miRNAlet-7f 【作 者】刘旭斌;余德奎;邹汉良;杨娟;陶绪雄;李杰

【作者单位】广东省深圳市坪山新区妇幼保健院普外科 518122;广东省深圳市坪山新区妇幼保健院普外科 518122;广东省深圳市坪山新区妇幼保健院普外科 518122;广东省深圳市坪山新区妇幼保健院普外科 518122;广东省深圳市龙岗中心医院 518100;武汉大学公共卫生学院,武汉 430070 【正文语种】中 文

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤类型之一，男性多于女性，具有发病率高、病死率高等特点，早期及时确诊是指导临床治疗、改善患者预后的关键。肝癌患者早期症状不明显或缺乏特异性，仅凭肝区疼痛、全身或消化道等症状难以确诊，传统检查手段如血清标志物甲胎蛋白(AFP)检测、影像学检查等均存在一定的漏诊、误诊，且确诊时大多数患者已是中晚期，临床治疗效果欠佳，预后较差[1]。近年来miRNA在肝癌发病机制中的作用逐渐引起关注，国内外研究已明确miRNA let-7与肝癌

的发生、发展密切相关[2-3]。但现有研究报道多数是关于let-7家族与肝癌细胞之间的关系，对let-7家族中miRNA的单个种类的研究不足，特别是针对let-7f的研究欠缺。动物试验表明miRNA let-7a、miRNA let-7f、miR-98等在大鼠早期肝癌中异常表达。现通过患者肝癌病变组织与癌旁组织；肝癌患者与健康对照者各指标水平的比较，探讨miRNA let-7a、miRNA let-7f在早期肝癌诊断中的临床价值。

1.1 一般资料 选取龙岗中心医院及合作医院2014年6月至2016年3月行肝癌切除手术的40例原发性肝癌患者。纳入标准：(1)均结合临床常规检查结果、手术病理结果等确诊。(2)年龄小于或等于70岁。(3)入院前未接受其他放、化疗或生物免疫治疗等。(4)签署知情同意书。排除标准：(1)合并心、肺、肾等器质性病变或其他恶性肿瘤者。(2)精神意识障碍者。男29例，女11例；年龄35～69岁，平均年龄(53.1±6.2)岁；入院时AFP为15.7～627.3 ng/mL，平均

(90.4±10.7)ng/mL。选取同期该院体检的40例健康者作为健康对照者，男31例，女9例；年龄32～70岁，平均年龄(53.5±6.4)岁。本研究经该院伦理委员会审核批准，且肝癌患者和健康对照者的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。 1.2 方法

1.2.1 血液标本及处理 肝癌患者手术前和健康对照者均抽取空腹静脉血5 mL，15～25 ℃静置60～120 min，血液凝固后常规离心1 500 r/min，10 min并提取上清液，标本装入去核糖核酸酶(RNase)的EP管中，-60 ℃冷存以备检测。按照1∶1的比例在血清标本中加入Trizol试剂，充分混匀后用苯酚/氯仿做去蛋白处理，将乙醇沉淀的RNA成分加入DEPC水中溶解，采用紫外分光光度法检测所提取的RNA纯度，检测后将提取的RNA低温保存。

1.2.2 组织标本及处理 肝癌患者手术采集肝癌病变组织和癌旁组织，其中癌旁组织

切取范围为距离癌灶边缘约3 cm以内，标本即刻低温-60 ℃保存。分别取0.1 g组织标本放入预冷的研钵中，加入适量液氮磨成粉末，待标本中液氮挥发后加入约3 mL的Trizol试剂，4 ℃下8 000 r/min离心，5 min后，获取上清液至EP试管中并加入200 μL氯仿，充分振荡混匀30 s以确保有机相、水相充分接触。15～25 ℃静置15～20 min后4 ℃下8 000 r/min离心，5 min，其中水相部分置于0.5 mL异丙醇的去RNase的EP管中，常规离心弃上清液后加入DEPC水溶解。采用紫外分光光度法提取总RNA，OD260/OD280比值大于或等于1.8，检测提取的RNA低温保存。

1.2.3 合成cDNA 严格按照TAKARA反转录试剂盒说明书进行操作，RT反应体系的配置在去RNase的PCR管中进行，将提取的总RNA浓度进行适当调整，RT反应体系充分混匀后40 ℃孵育反转录60 min，90 ℃孵育10 min灭活反转录酶。 1.2.4 荧光定量PCR检测 取适量cDNA置于去RNase的PCR试管中，内侧基因为β-actin，根据试剂盒说明书加入上下游引物，2 μL通用引物、2 μL的let-7a和let-7f目的引物、4 μL的无酶水和2×SYBR Green PCR Master MiX，建立20 μL的反应体系。反应相关参数设置：预变性95 ℃,15 min，共40个循环；变性95 ℃,30 s，退火56 ℃,20 s，延伸72 ℃,40 s，观察并收集荧光信号。 1.2.5 数据分析 根据cDNA浓度梯度的log值作△CT值图，采用实时荧光定量Real-time PCR相对定量法检测组织和血清标本的miRNA let-7a、let-7f水平。以U6表达量为内参，miRNA let-7a、let-7f用2-△△CT表示，其中CT值表示每个PCR管内的荧光信号到达设定阈值期间所经历的循环数，△CT=检测值平均CT-U6平均CT，△△CT=待检测标本△CT―校准标本△CT。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，使用EpiData3.软件行双份录入，利用人工和计算机对数据进行再次核查确保数据的客观、准确性，纠正逻辑错误和锁定数据集。肝癌患者组织、血清标本miRNA let-7a、let-7f为计量资

料以±s表示，组间比较行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 2种组织标本检测结果比较 肝癌患者病变组织标本miRNA let-7a、let-7f分别低于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1和图1、2。

2.2 肝癌患者与健康对照者血清标本检测结果比较 患者血清miRNA let-7a、let-7f分别低于健康对照者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2和图3、4。 我国乙型肝炎病毒相关性肝癌的发病率和病死率均较高，且呈上升趋势。目前治疗肝癌的手段较多，如外科切除术，经皮肿瘤清除和肝移植治疗，热疗等，但对化疗不敏感，因确诊的延误和肿瘤转移扩散，导致部分患者临床治疗效果不满意，复发率和病死率仍较高[4]。miRNA是近年来发现的一种具有调节作用的内源性单链小分子RNA，长度约为20～22个核苷酸，在真核生物中广泛分布。目前经鉴定的人类miRNA高达700余种，其广泛的分布性和稳定特异性的表达对参与调节人体细胞代谢、增殖、凋亡、分化、发育具有重要的影响[5]。多数学者认为miRNA相关表达机制可能是通过改变处理酶和启动子超甲基化等实现[6]。

目前miRNA具有致癌基因和肿瘤抑制基因的作用已被普遍认可，有研究探讨子宫内膜样腺癌组织和正常内膜组织的miRNA表达谱及差异，发现共有18个miRNA在子宫内膜样腺癌中呈异常上调表达，31个miRNA呈明显下调表达等，可作为临床区分不同分化子宫内膜样腺癌的重要生物标志物[7]。国外研究报道，结缔组织生长因子(CTGF)和核因子NF-κB受体活化因子配体(RANKL)是miR-18的靶基因，提示肝癌的发生、进展与miRNA紧密相关[8]。

本研究认为：(1)目前对let-7家族中miRNA的单个种类研究较少。(2)let-7家族作为最早发现的一类minRNA，主要包括 let-7a、let-7f、7i、miRNA-98等13个成员，随着miRNA对肝癌生物和分子功能研究的逐渐加深，let-7家族成为关注的热点。本研究结果显示，肝癌患者病变组织miRNA let-7a、let-7f水平分别为(0.18±0.04)×103、(0.19±0.01)×103，均明显低于癌旁组织表达(P<0.01)；且

肝癌患者血清miRNA let-7a、let-7f水平也低于健康对照者(P<0.01)，提示肝癌发病和miRNA let-7a、let-7f的表达高度相关，血清检测水平偏低预示肝癌的可能。有研究报道，microRNA let-7a可通过下调CD133+Huh7肝癌干细胞内的wnt/β-catenin信号通路的转录活性，从而达到抑制肝癌干细胞增殖和转移的靶向功能[9]。还有研究表明，let-7对肝癌高迁移率族蛋白A2癌基因也具有抑制作用[10]。本研究认为miRNA let-7a、miRNA let-7f在肝癌患者中呈异常下调表达，肿瘤细胞基因的靶向功能失调是引起肝癌的重要机制，高敏感性指标miRNA let-7a、miRNA let-7f 可作为早期诊断的重要标志物。

综上所述，miRNA表达和肝癌发病密切相关，miRNA let-7a、miRNA let-7f水平在病理组织和血清标本中均明显下调，早期加强血清相关指标检测，对早期诊断、指导临床治疗、改善预后具有重要的临床意义。

按工作性质及其先后顺序，可将医学统计工作分为实验设计、收集资料、整理资料、分析资料。实验设计是开展某项医学研究工作的关键，包括医学专业设计和统计学设计，医学专业设计的内容包括研究对象纳入和排除标准、样本含量、获取样本的方法、分组原则、观察(检测)指标、统计方法等。收集资料的方法包括各种试验、检测或调查，要求资料完整、准确、及时、有足够数量、具有代表性和可比性等。整理资料包括原始资料的检查与核对、对资料进行分组与汇总等。分析资料即对资料进行统计学分析，包括进行统计描述和统计推断。 【相关文献】

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