胶内酶切及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定操作步骤

1． 凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。

★凝胶染色分为：A:银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色 ★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒

2． 凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。

★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。 ★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤：

①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min ②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机）

3． 凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min.

4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。

★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。）

5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。 6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。

7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。（冻干的肽段放-20度冰箱保存） 8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。）

9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。待干，再点0.5ul基质，上质谱。

溶液配制

1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中 2．脱色液配方 乙腈：50mMNH4HCO3=1:1

3. 10mmol/LDTT还原液：称取1.mg溶于1ml100mMNH4HCO3中

4．55mmol/L烷基化溶液： 称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中 5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug -20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。)

6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.01ug于25mMNH4HCO3溶液（2ul稀释50倍=100ul） 7．肽提取液I:5%TFA(v/v)水溶液 8．肽提取液II: 乙腈：5%TFA=1:1

MALDI-TOF-TOF操作手册

一：反射模式校正/测量样品的简单操作流程 1.将靶的缺角放在左下角，准备进靶。

2.新建一个spot set，或者打开一个以前建好的spot set。 3.进靶，选定靶的spot set。

4.打开Acquisition Method一级方法 ,根据校正模式修改设置，保存。 5.打开Processing Method一级方法, 根据校正模式修改设置，保存。 6.选定CAL1-CAL13进行一级校正。

7.打开Acquisition Method二级方法 ,根据校正模式修改设置，保存。 8.打开Processing Method二级方法, 根据校正模式修改设置，保存。 9.选定CAL6-CAL8进行二级校正。

10. 将Acquisition Method一级方法、Processing Method一级方法、Acquisition Method二级方法、Processing Method二级方法，根据测量模式修改设置，保存。

11.打开一、二级联用的方法Interpretation Method,将改好的Acquisition Method二级方法、Processing Method二级方法填入，保存。

12.在job模式下，填好需要测量的点，填好测量方法，进行一、二级测量。

二：反射模式校正/测量样品的详细操作流程 ★打开软件的初始界面：

提交job 运行、暂停、终止job 测量方法 采集方法 进靶 一、二级联用方法 激光开关 信号强弱 质谱图 分子量 靶可视窗口

★新建一个spot set

★ 进靶，选定靶的spot set ★ Name your spot set

进靶

★Name your plate

★select a spot set template

选择384 Opti-TOF

然后选择select

★spot set massager

可以根据条件打开之前某一/几次job

★Job窗口

一级校正模式 测量模式 二级校正模式

★打开Acquisition Method一级方法

★打开Acquisition Method一级方法

Acquisition Method二级方法 Acquisition Method一级方法

★Acquisition Method一级方法的修改界面

待检测样品的分子量范围 一般为700-4000Da 关心的分子量焦点

★Acquisition Method一级方法的修改界面

激光在测量中移动的次数和时间

★Acquisition Method一级方法的修改界面

激光强度（用以下几条标准来调整）： ①校正时，以使得信号强度达到e*104以上为准 ②测量时，以使得信号强度达到5000以上为准

★打开Processing Method一级方法

★打开Processing Method一级方法

Processing Method二级方法 Processing Method一级方法

★Processing Method一级方法的修改界面

一级测量模式

★Processing Method一级方法的修改界面

一级校正模式 校正参数的设置： Min S/N : 20 Mass Tolerance :+/-0.5 Min Peaks to match：5 or 4 Max Outlier Error：20——>10——>5

修改后保存，然后在job中选定待校正的CAL1-CAL13进行一级校正。

★打开Acquisition Method二级方法 ,根据校正模式修改设置

进行二级校正的母离子分子量：1606.855 （这是因为校正的标准品为马心肌红蛋白，1606.855是它最常见且信号比较强的一个肽段分子量值。）

★打开Acquisition Method二级方法 ,根据校正模式修改设置

激光在测量中移动的次数和时间

★打开Acquisition Method二级方法 ,根据校正模式修改设置

激光强度（用以下几条标准来调整）： ①校正时，以使得信号强度达到e*104以上为准 ②测量时，以使得信号强度达到3000以上为准

★ .打开Processing Method二级方法

二级测量模式

★打开Processing Method二级方法,根据校正模式修改设置

二级校正模式 校正参数的设置： Min S/N : 10 Mass Tolerance :+/-0.5——>0.2——>0.1 Min Peaks to match：5 or 4 Max Outlier Error：50——>20——>10

修改后保存，然后在job中选定待校正的CAL6-CAL8进行二级校正。

★打开一、二级联用的方法Interpretation Method

★打开一、二级联用的方法Interpretation Method,将改好的Acquisition Method二级方法、Processing Method二级方法填入，保存。

将改好的Acquisition Method二级方法填入 将改好的Processing Method二级方法填入

★在job模式下，填好需要测量的点，填好测量方法，通过提交、运行、暂停和终止操作来进行一、二级测量。

Acquisition Method一级方法 提交job 运行、暂停、终止job Processing Method一级方法 一、二级联用的方法选定需要进行一、二级测量的点 Interpretation Method

The parameters were set as follows:

MS (precursor-ion) peak filtering: 700–4000 Da interval, monoisotopic, minimum S/N= 20, mass tolerance =

+/-0.5M/Z; MS/MS (fragment-ion) peak filtering: monoisotopic, M1H1, minimum S/N=10, MSMS fragment tolerance

= 0.1 Da; database used:ncbi-green plants. During the initial MS scan, the data were analyzed as PMF and preliminary protein ID was done by searching against the database using the MASCOT (Matrix Science, Boston, MA) algorithm.

Only proteins with total Protein Score

C.I.%.95% were considered as a positive ID.

The samples were analyzed using an ABI 4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF mass spectrometer

(Applied Biosystems, Foster City, CA), and protein identification (ID) was performed using the Result Dependent

Analysis (RDA) of ABI GPS Explorer software, version 3.5 (Applied Biosystems). The parameters were set as follows: MS (precursor-ion) peak filtering: 800–4000 m/z interval, monoisotopic, minimum S/N=10, mass tolerance =

75 ppm; MS/MS (fragment-ion) peak filtering: monoisotopic, M1H1, minimum S/N=3, MSMS fragment tolerance

= 0.2 Da; database used: Listeria taxonomic sub-database

of “nr” (non redundant) database of National Center for Biotechnology Information. During the initial MS scan, the data were analyzed as PMF and preliminary protein ID was done by searching against the database using the MASCOT (Matrix Science, Boston, MA) algorithm. Proteins with high confidence ID (Cross Confidence Interval

(C.I.%).95%) were automatically selected for “in silico” digestion, and their three most prevalent corresponding peptides-precursor ions present in the MS spectra were

selected for MS/MS analysis–RDA_1 (top protein confirmation). The sample spots not yielding high confidence ID after preliminary PMF ID and/or after RDA_1 ID were

subjected to RDA_2 by selecting the first 20 most intensive precursor ions in the MS spectra for MS/MS analysis. The spectral data from the PMF (initial MS scan), RDA_1 and RDA_2 MS/MS were together subjected to a combined MASCOT search. Only proteins with total Protein Score C.I.%.95% were considered as a positive ID. The functional categories of the identified proteins were determined according to the ListiList Listeria genome database (http:// genolist.pasteur.fr/ListiList/).