一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法[发明专利]

*CN1019626A*

(10)申请公布号 CN 1019626 A(43)申请公布日 2011.02.02

(12)发明专利申请

(21)申请号 201010523637.0(22)申请日 2010.10.28

(71)申请人浙江出入境检验检疫局检验检疫技

术中心

地址310012 浙江省杭州市西湖区文三路2

号(72)发明人张晓峰 帅江冰 吴姗 陈笑梅

何永强(74)专利代理机构浙江翔隆专利事务所 33206

代理人张建青(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)G01N 21/(2006.01)

()发明名称

一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法(57)摘要

目前对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。本发明公开了一种通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，其特征在于针对HEVORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针；四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测。本发明保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点，四重荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为传染源调查、传播环境、病毒溯源等工作奠定基础。CN 1019626 A权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 4 页

CN 1019626 ACN 101962690 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEV ORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针：

所述的扩增引物序列为：

HEV-F TATTCATCCAACCAACCCCTT，HEV-R GTCDCGCCAAGYGGAGC，

该引物为针对不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C；

所述的TaqMan探针序列为：

I-P CY5-TGTCACCGCTGCGGCCG-BHQ3，II-P ROX-AGACGTTGCCGCTGCGTCC-BHQ2，III-P HEX-TTTCACAAYCCGGGGCTGGA-BHQ 1，IV-P FAM-CGCATCTGACATWCCARCCGC-BHQ 1，四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列中Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G；

PCR鉴别检测方法的步骤如下：1)将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30μLDEPC水溶解；

2)在PCR反应管中配置反应体系，体系的总体积为25μl，其组成如下：10μl荧光定量PCR Mix，1.2μl浓度为10μM的HEV-F，1.2μl浓度为10μM的HEV-R，0.5μl浓度为10μM的I-P，0.5μl浓度为10μM的II-P，0.5μl浓度为10μM的III-P，0.5μl浓度为10μM的IV-P，8μl HEV阳性RNA模板，双蒸水补至25μl；

3)将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件如下：第一阶段：42℃，30min；第二阶段：95℃，3min；第三阶段：95℃，10s，60℃，45s，45个循环，并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号；

4)阴性对照CT值应显示为0或≥40.0，阳性对照的CT值应≤30.0，否则视实验失败，需重做；检测样品CT值≤35.0，结果有效，直接报告样品阳性；检测样品35.0＜CT值＜40.0，需进行一次重复实验，若CT值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照CT值为零，报告样品阳性，否则报告样品阴性；检测样品CT值为零，报告样品阴性。

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说 明 书

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一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法

技术领域

[0001]

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种人血清、动物血清及其产品、食品以及环境中通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法。

背景技术

[0002] 戊型肝炎(Hepatitis E)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起，是一种经粪-口传播、以黄疸为主的急性传染病，患病孕妇的病死率更可高达21％。自1955年印度发生第一次大暴发以来，戊型肝炎已在亚洲、非洲与拉丁美洲的很多国家广泛流行。近年来该病亦在日本等发达国家散发流行。我国是戊型肝炎高发的国家，、辽宁、山东等省均有大量流行，极大的危害人类健康。有证据显示，戊型肝炎是一种动物源性疾病，被感染的家养或野生动物可直接传播或通过污染水源传播本病。有研究表明，猪源戊型肝炎病毒可以感染恒河猴和黑猩猩等灵长类动物，而人戊型肝炎病毒在实验条件下也能成功感染猪等动物；血清学调查则发现与猪频繁接触的人群(如饲养员、兽医、屠工)中戊型肝炎病毒的抗体水平明显高于正常人群。日本亦有人因食用了未煮熟的猪肝和鹿肉而引起急性戊肝的报道，提示了猪戊型肝炎病毒在公共卫生和食品安全方面存在的重大意义。[0003] HEV是无包膜的单股正链RNA病毒，其基因组长约7.5kb，有3个开放阅读框。根据HEV各分离株的基因组序列分析，可将其分为4个主要的基因型。I型主要发生于亚非多数国家；II型分离于墨西哥；III型发生于美国和一些欧洲国家；IV型发生于亚洲。其中I型和II型只能感染人，III型和IV型则为人畜共患，可感染人、猪和其它动物。在我国流行的HEV主要为由I型和IV型。但有研究表明，上海地区猪场中已有III型HEV毒株的流行。

[0004] 迄今为止，对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。这就需要建立一种通用的、高度敏感、特异和快速的检测方法用于HEV的诊断。同时，HEV主要经污染的水源和环境传播，高度敏感的病原检测技术也将有助于分子流行病学调查和病毒溯源。而目前可同时快速鉴定戊型肝炎病毒各个基因型的方法尚无报道。发明内容

本发明的目的是提供一种戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，利用TaqMan

探针技术建立I、II、III和IV型HEV的多重荧光快速分型检测体系，以期填补技术空白。[0006] 为此，本发明采用如下的技术方案：一种不同基因型戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEV ORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针：

[0007] 所述的扩增引物序列为：

[0008] HEV-F TATTCATCCAACCAACCCCTT，[0009] HEV-R GTCDCGCCAAGYGGAGC，

[0005]

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CN 1019626 ACN 101962690 A[0010]

说 明 书

2/7页

该引物为针对不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C。[0011] 所述的TaqMan探针序列为：

[0012] I-P CY5-TGTCACCGCTGCGGCCG-BHQ3，[0013] II-P ROX-AGACGTTGCCGCTGCGTCC-BHQ2，[0014] III-P HEX-TTTCACAAYCCGGGGCTGGA-BHQ1，[0015] IV-P FAM-CGCATCTGACATWCCARCCGC-BHQ1，

[0016] 四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列种Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G。

[0017] PCR鉴别检测方法的步骤如下：[0018] 1)将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30μL DEPC水溶解。

[0019] 2)在PCR反应管中按下表所述配置反应体系：

[0020]

3)将PCR反应管置于ABI7500、Roche LightCycler480、Qiagen Rotor Gene 6000

等荧光定量PCR仪中，并按下述反应条件进行检测：[0022] 第一阶段：42℃，30min；[0023] 第二阶段：95℃，3min；[0024] 第三阶段：95℃，10s，60℃，45s，45个循环；

[0025] 并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号。[0026] 4)阴性对照CT值应显示为0或≥40.0，阳性对照的CT值应≤30.0，否则视实验失败，需重做。检测样品CT值≤35.0，结果有效，可直接报告样品阳性。检测样品35.0＜CT值＜40.0，需进行一次重复实验，若CT值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照CT值为零，可报告样品阳性，否则报告样品阴性。检测样品CT值为零，报告样品阴性。

[0027] 本发明通过对已发表的不同基因型HEV毒株全序列进行分析后，针对HEVORF3序列设计一对保守引物，能同时扩增不同基因型HEV毒株，进一步针对此扩增区域的变异区设计四条型特异性探针，分别标记有不同的荧光基团，用于对4种不同基因型的一步法鉴

[0021]

4

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说 明 书

3/7页

别诊断。基于TaqMan探针的荧光定量PCR保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点。四重荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为传染源调查、传播环境、病毒溯源等工作奠定基础。

[0028] 下面通过实施例和说明书附图对本发明进行详细描述。附图说明

图1本发明荧光定量PCR方法敏感性(图1A)及其标准曲线分析(图1B)：I型

HEV通道，模板浓度依次为2×102-108拷贝。

[0030] 图2本发明荧光定量PCR方法敏感性(图2A)及其标准曲线分析(图2B)：II型HEV通道，模板浓度依次为2×102-108拷贝。

[0031] 图3本发明荧光定量PCR方法敏感性(图3A)及其标准曲线分析(图3B)：III型HEV通道，模板浓度依次为2×102-108拷贝。

[0032] 图4本发明荧光定量PCR方法敏感性(图4A)及其标准曲线分析(图4B)：IV型HEV通道，模板浓度依次为2×102-108拷贝。

[0029]

具体实施方式

[0033] 1材料和方法

[0034] 1.1HEV多重荧光定量PCR方法的建立[0035] 1.1.1引物及探针的设计合成

[0036] 通过已发表的不同基因型HEV毒株全序列进行分析后，针对HEV ORF3序列设计一对保守引物，能同时扩增不同型HEV毒株。同时针对此扩增区域的变异区分别设计四条型特异性探针，分别标记有不同的荧光基团，用于HEV的一步法荧光定量PCR检测(表1)：[0037] 表1引物及探针序列

[0038]

[0039]

a

兼并引物中D代表碱基A、G或T；Y代表碱基T或C；W代表碱基A或T；R代表碱

基A或G

1.1.2荧光定量PCR反应条件优化

[0041] 利用HEV阳性RNA模板作为检测样品，对引物和探针浓度从0.05～0.6μmol/L进行优化，并对退火温度等反应条件进行优化，筛选出最佳的荧光定量PCR反应条件。[0042] 1.1.3荧光定量PCR标准曲线分析及敏感性试验

28

[0043] 将2×10-10拷贝/μL的四种基因型HEV阳性RNA模板分别混合，进行荧光定量PCR，设3个重复，以确定四重荧光定量PCR方法的标准曲线及其检测限。并与普通套式PCR

[0040]

5

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说 明 书

4/7页

方法的检测灵敏度进行比较优化。[0044] 1.1.4干扰性试验

[0045] 将四型HEV病毒RNA模板按不同浓度混合，并利用建立的分型体系进行检测，以确定四种病毒的探针、引物之间是否存在相互干扰现象。[0046] 1.1.5特异性及重复性试验

[0047] 利用本发明建立的荧光定量检测方法，对其它主要的猪传染性病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)等进行检测，以确定该方法的特异性。以102～106拷贝的标准品进行检测，每个样品3个重复，通过计算标准差(SD)和变异系数(CV)来验证荧光定量PCR的批内重复性。同时进行方法的批间重复性分析，即102～106拷贝的每个标准品分别检测3次，并计算标准差(SD)和变异系数(CV)。[0048] 1.2样品采集和处理

[0049] 人或动物血清样本采集后-76℃保存备用，用于HEV核酸的荧光定量PCR检测。环境拭子、产品或猪粪便等样品采集后制成20％的悬液(w/v)，10000r/min离心20min，小心吸取上清，-76℃保存备用。

[0050] 1.3RNA提取及HEV的荧光定量检测

[0051] 将样品上清按TRIZOL Reagent使用说明提取RNA，最后加入30μL DEPC水溶解，利用所建立的荧光定量PCR方法进行HEV的检测。[0052] 2结果

[0053] 2.1荧光定量PCR反应条件优化

[00] 不同的引物和探针终浓度配比试验结果结合仪器要求，荧光定量PCR反应最佳退火温度为60℃，最终反应条件为：第一阶段：42℃，30min；第二阶段：95℃，3min；第三阶段：95℃，10s，60℃，45s，45个循环；并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号。20μL的反应体系中上下游引物及四种型特异性探针的最适终浓度为分别0.6μmol/L和0.25μmol/L。反应体系如下表；[0055] 表2荧光定量PCR反应体系

[0056]

2.2HEV荧光定量PCR检测方法灵敏度分析

28

[0058] 以10倍系列稀释的四种型HEV阳性RNA混合液(2×10-10拷贝)为模板进行定量扩增并分析其标准曲线(图1-图4)。结果表明本发明的荧光定量方法对于不同基因型的HEV都具有较高的扩增效率(97.15％-98.78％)。而且该方法对不同基因型模板的检测

[0057]

6

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说 明 书

5/7页

下限均可达102拷贝，具有很高的灵敏度。其对高浓度模板也具有很好的检测效果，表明此方法具有很广的线性范围，适用于临床不同条件、多种样品的检测。而常规套式PCR最低仅能检出含量为5×102～5×103的模板，因此荧光定量PCR方法相比于普通PCR，其检测灵敏度要高10-100倍。[0059] 2.3抗干扰试验

[0060] 将四种基因型HEV模板按不同浓度混合后进行多重荧光定量PCR检测，不同浓度组合均能同时扩增出四种基因型HEV，不产生干扰。[0061] 2.4荧光定量PCR检测体系的特异性和稳定性[0062] 进一步对该方法的特异性和稳定性进行分析。结果显示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)等对照在该体系中不同信号通道检测均为阴性，表明该方法特异性强，与其他主要传染性病原无交叉反应性。

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[0063] 对不同含量的各基因型阳性样品(10～10拷贝)进行荧光定量检测，每个样品3个重复，结果表明各通道检测变异系数(CV)为0.04％～0.63％(表3，Green通道)，具有良好的批内稳定性。同时进行方法的批间重复性分析，即102～106拷贝的每个标准品分别检测3次，不同浓度模板3次试验平均CT值间变异系数介于0.12％和1.26％，说明该方法也具有很高的批间稳定性。

[00] 表3Green通道荧光定量PCR体系稳定性分析

[0065]

2.5不同地区人群及猪群中HEV核酸检测

[0067] 利用一步法荧光定量PCR对浙江省内抗体阳性的人血清样本及采集自浙江、上海、江苏等不同地区规模化猪场的样品进行HEV病毒核酸的四重荧光定量检测。其中，77份HEV抗体阳性的人血清样本仅有2份为IV型HEV核酸阳性，阳性率为2.6％。而18个不同地区猪场的273份猪粪便样品中有55份检测到IV型HEV核酸(阳性率20.5％)，一份样品为III型HEV阳性。且所有地区的猪场均能检测到猪HEV核酸，地区覆盖率100％，表明猪HEV已经在规模化猪场中广泛存在。[0068] 序列表

[0069] <110>浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

[0070] <120>一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法[0071] <130>

[0066]

7

CN 1019626 ACN 101962690 A[0072] [0073] 说 明 书

6/7页

<160>6

<170>PatentIn version 3.3[0074] <210>1[0075] <211>21[0076] <212>DNA

[0077] <213>人工合成[0078] <220>

[0079] <221>primer bind[0080] <222>(1)...(21)[0081] <400>1

[0082] tattcatccaaccaacccctt 21[0083] <210>2[0084] <211>17[0085] <212>DNA

[0086] <213>人工合成

[0087] <220>

[0088] <221>primerbind[00] <222>(1)...(17)[0090] <400>2

[0091] gtcdcgccaagyggagc 17[0092] <210>3[0093] <211>17[0094] <212>DNA

[0095] <213>人工合成[0096] <220>

[0097] <221>primer bind[0098] <222>(1)...(17)[0099] <400>3

[0100] tgtcaccgctgcggccg 17[0101] <210>4[0102] <211>19[0103] <212>DNA

[0104] <213>人工合成[0105] <220>

[0106] <221>primer bind[0107] <222>(1)...(19)

[0108]

<400>4

[0109] agacgttgccgctgcgtcc 19[0110] <210>5

8

CN 1019626 ACN 101962690 A[0111] [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] 说 明 书

7/7页

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成<220>

<221>primer bind

<222>(1)...(20)<400>5

tttcacaayccggggctgga 20[0119] <210>6[0120] <211>21[0121] <212>DNA

[0122] <213>人工合成[0123] <220>

[0124] <221>primer bind[0125] <222>(1)...(21)[0126] <400>6

[0127]

cgcatctgacatwccarccgc 21

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说 明 书 附 图

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图1A

图1B

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说 明 书 附 图

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图2A

图2B

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说 明 书 附 图

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图3A

图3B

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说 明 书 附 图

4/4页

图4A

图4B

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