疫苗中和抗体体外检测方法的研究进展-论文

３７４　中国医药生物技术２００８年１０月第３卷第５期　ＣｈｉｎＭｅｄＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２００８，Ｖｏ！３，Ｎｏ．５　·综述·　疫苗中和抗体体外检测方法的研究进展　查锦芬，肖长义，佐满珍　中和抗体是抗病毒免疫的主要因素，也是疫苗免疫治疗　效果的重要检测指标之一。预防疫苗的免疫保护性主要体现　于是否可诱导出高滴度的中和抗体，因此中和抗体活性也是　疫苗评估和质控的重要依据。迄今为止，根据已知抗原特性、　抗原与抗体反应特点以及结果判定方法的不同，已建立了多　种病毒中和抗体活性的体外测定方法。本文就近年来关于中　和抗体活性体外测定方法的最新研究进展做一综述。　１病毒中和试验　中和试验是一种以测定病毒的感染力为基础，以比较病　毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，进而判定免疫血　清中和病毒能力的方法。最早的病毒中和试验采用动物接　种，测定受病毒感染后血清中残存病毒的感染力，而目前这　方法已全部被细胞水平的中和试验所取代。现今，病毒中　和抗体的细胞中和试验种类繁多，而每种方法均以判定残存　病毒感染力作为标准，现简要叙述如下。　１．１细胞病变中和试验　很多病毒均可导致靶细胞发生病变，因此可通过观察血　清中和抗体中和病毒后的细胞病变程度，测定相应的中和抗　体水平。该方法观察结果直观，但需要时间较长，适用于实　验室对于少量或不急于获得结果的样本的中和抗体鉴定。基　于以往的试验都存在需要在显微镜下观察细胞病变，受观察　者主观因素的影响较大，并且很难根据细胞病变程度定量测　定中和抗体活性等不足，Ｗａｎｇ等［１］通过研究建立了斑点减　少（ｐｌａｑｕｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ＰＲ）和中性红染色（ｔｈｅ　ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＮＲＳ）试验这２种附加方法，用来检测抗严重急　性呼吸综合征相关冠状病毒（ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，ＳＣＶ）中和抗体的活性。ＰＲ是在传　统的病毒斑点减少试验的基础上采用改良结晶染色方法从　而使形成的斑点更加明确的一种方法，而ＮＲＳ是通过检测　细胞对中性红染料的摄取能力来计算细胞存活力的一种方　法。ＰＲ、ＮＲＳ附加方法和以往基于细胞病变的中和试验方　法所测得的中和抗体活性，具有高度的一致性和特异性。　１．２斑点减少中和试验　正常细胞在代谢过程中都可以摄入活性染料（如中性　红），但在病毒感染时，细胞则会丧失染料摄取能力，而形　成无色的细胞蚀斑，因此，病毒被抗体中和后，细胞蚀斑的　形成数量也随之减少，据此就可以计算出病毒中和抗体的效　价。Ｂｏｒｇｅｓ等［２】将１８２例有痘苗接种史的受试者按年龄　（３１～３５岁和≥３５岁）分为２组，对斑点减少中和试　验（ｐｌａｑｕｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｎｅｕｔＴａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ，ＰＲＮＴ）的重复性及　可靠性进行横向调查，结果显示该方法具有很好的敏感性　（９２．７％）、特异性（９０．８％）和优秀的重复性［ＩＣＣ０．８９（０．８８，　０．９２）］。　ＰＲＮＴ虽可以提供比较可靠的结果，但还要依赖于人工　计数，需要强大的劳动力。但为了更有效地推进疫苗临床评　估的进程，则需要一种更为快速、可靠、有效的中和试验。　就此，Ｚｉｅｌｉｎｓｋａ　３】提出了用图像分析进行斑点计数的改良　方法，通过与手工和自动化计数方法比较，对标准和对照血　清进行检测以确定这种改良方法的适用性和准确度，结果显　示改良后ＰＲＮＴ方法和原始ＰＲＮＴ方法的检测结果高度　相关（ｒ＝０．９５８０），充分表明了这种半自动化改良方法的可　靠性，可用于疫苗临床试验对中和抗体滴度的评估。此方法　最大的优点就是克服了人工计数费时费力和主观性等弊病，　而且对于不确定的斑点计数结果可以储存后再作分析。　１．３·陕速荧光灶抑制试验　快速荧光灶抑制试验（ｒａｐｉｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｆｏｃｕｓ　ｉｎｈｉｂｉｉｔｏｎ　ｔｅｓｔ，ＲＦＦＩＴ）是将固定量的病毒与系列稀释的待测血清在　体外中和后，加入敏感细胞孵育，最后用荧光标记的抗核蛋　白抗体染色，以检测未被中和的残余病毒（荧光灶），最后　与病毒对照组比较，计算各种待测血清病毒荧光灶单位减少　５０％的稀释度，然后与已知滴度的参考血清比较，计算每　种待测血清的中和抗体滴度。ＲＦＦＩＴ试验需要的人力、时　间、实验室和动物饲养空间均较少，一次可检测多种血清样　本，而且通过多次体外ＲＦＦＩＴ与小鼠体内血清中和试验的　比较研究，ＲＦＦＩＴ被认为已完全可以取代小鼠血清中和试　验。Ｖｅｎｅ等ｌ４　为评估蜱传脑炎疫苗免疫后的抗体反应，分　别用ＲＦ兀Ｔ、血凝抑制（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｉｔｏｎ，ＨＩ）　试验和ＥＬＩＳＡ方法对抗体活性进行了检测，结果在有　３次疫苗接种史的受试者中，ＲＦＦＩＴ的灵敏度＞９０％，而　Ｈｌ试验和ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度仅为７７％；在有４～５次　疫苗接种史的受试者中，ＲＦＦＩＴ的灵敏度＞９８％，而ｍ试　验和ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度为８９％～９５％，证实ＲＦＦＩＴ具　有很高的灵敏度。另外，由于ＨＩ试验和ＥＬＩＳＡ方法都易　受交叉反应的限制，因此ＲＦＦＩＴ被认为是检测蜱传脑炎最　特异、有效的方法。　基于ＲＦＦＩＴ中用来标记抗体的异硫氰酸荧光素的　价格比较昂贵。Ｋｈａｗｐｌｏｄ等　】利用携带有绿色荧光蛋白　基金项目：国家自然科学基金（３０７７０ｌｏ４）；湖北省卫生厅课题［鄂卫科　（２００６）９７号ＪＸ３Ｂ３２］：湖北省教育厅重大课题［鄂教科（２００７）４号　Ｚ２００７１３００２］　作者单位：４４３００２宜昌，三峡大学医学院科研科　通讯作者：肖长义，Ｅｍａｉｌ：ｘｉａｏｃｈｙ＠ｃｔｇｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　收稿日期：２００８．０５．１５　维普资讯 http://www.cqvip.com 中国医药生物技术２００８年１０月第３卷第５期　ＣｈｉｎＭｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２００８，Ｖｏ１．３，Ｎｏ．５　３７５　（ｇｒｅｅｎ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因的重组狂犬病毒株作　为攻击病毒，建立了一种新的ＲｍＴ方法，用荧光显微镜　检测感染病毒的细胞内ＧＦＰ的表达，以检测未被中和的残　余病毒，他们分别用ＲｍＴ与新的ＲＦＦＩＴ－ＧＦＰ方法同时　对２５例受试者、ｌ８只犬、１５匹马的血清进行了检测，２种　方法的检测结果显示出很好的一致性（ｒ＝０．９８）。证实了这　种新方法不仅方便、经济，又非常可靠，而且也可以用于其　他病毒的检测。　１．４荧光基础微量中和试验　传统的斑点减少试验比较费力，而且从细胞培养到读数　常常需要至少一个星期的时间。Ｗａｎｇ　６Ｊ利用表达ＧＦＰ　的人巨细胞病毒（ｈｕｍａｎ　ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＨＣＭＶ）重组体　建立了荧光基础微量中和试验，并与传统的斑点减少试验进　行比较，回归分析显示，２种方法的关联度，≥０．９２。该　方法适于检测所有能标记加强ＧＦＰ的病毒，实现了自动化　操作，适用于大规模样本的检测，与传统的斑点减少试验相　比，荧光基础微量中和试验所具备的一个最大优势就在于计　算斑点和细胞病变时剔除了人为主观性，但同时也可能存在　潜在的误差。　１．５细胞结合抑制试验　虽然体外中和试验是人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）疫苗临床前期评估的最好指标，但作　为大规模的临床检测，该方法不仅费用高，而且比较费时。　所以，人们又利用中和性抗体可识别病毒颗粒（ＶＬＰ）抗原　表位的原理，设计了通过检测抗体来评估疫苗刺激产生免疫　保持能力的方法。但是以ＶＬＰ为抗原的ＥＬＩＳＡ方法和　ＨＩ试验或存在种属、型别的限制，或存在步骤复杂、成本　昂贵以及不能直接反映抗体的中和保护作用等缺点，为此，　宋建明　以ｐｃＤＮＡＬ１质粒免疫啮齿类动物（Ｃ５７ＢＬ／６），观　察ＨＰＶ１６Ｌ１　ＶＬＰ细胞结合抑制试验是否可以用于检测免　疫抗体的中和保护作用，结果证实试验组血清具有抑制　ＶＬＰ与人宫颈癌Ｈｅｌａ细胞黏附的活性效应。说明细胞结　合抑制试验可能比ＨＩ试验更能直接反映中和抗体的活性　和保护作用。　２酶标记检测方法　２．１　Ｅ　ＬｌＳＡ方法　病毒中和试验是ＷＨＯ认定的目前检测中和抗体的参　考方法，但是该试验不仅耗时、花费较贵，而且还需要很好　的实验室设备以及技术人员和活病毒。而ＥＬＩＳＡ方法则既　简单（不需要特殊的实验设备）又安全（不需要活病毒）、　快速（少于４　ｈ），可用于抗糖蛋白中和性抗体的定量检测，　但与病毒中和试验的一致性欠佳，而单克隆抗体的出现则明　显增加了ＥＬＩＳＡ方法的特异性。Ｍｕｈａｍｕｄａ等『８　利用小鼠　中和性单克隆抗体和人体免疫后血清抗体之间的竞争性建　立了竞争性ＥＬＩＳＡ（Ｃ—ＥＬＩＳＡ）方法检测狂犬病疫苗中和　抗体，他们利用经病毒中和试验检测证实为阴性和阳性的血　清样本确定小鼠中和性单克隆抗体的最佳稀释度和抑制阈　值后，用Ｃ—ＥＬＩＳＡ检测各血清样本，结果所有经ＲＦＦＩＴ检　测为阳性的血清经Ｃ—ＥＬＩＳＡ检测也均为阳性，而且　Ｃ—ＥＬＩＳＡ检测的抗体滴度均高于ＲＦＦＩＴ，２种方法的关联　系数，＝０．８９７。因此与ＲＦＦＩＴ相比，可认为Ｃ—ＥＬＩＳＡ的　特异性和灵敏度均达到１００％，提示Ｃ—ＥＬＩＳＡ可用于定量　检测抗狂犬病毒中和抗体水平。　另外，中和性单克隆抗体作为捕获性抗体和检测　性抗体也可用于单克隆相关的间接ＥＬＩＳＡ（ｍａｂ。ｌｉｎｋｅｄ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ，ＭＬＩ—ＥＬＩＳＡ）和竞争性ＥＬＩＳＡ（ｍａｂ—ｌｉｎｋｅｄ　ｃｏｍｐｅｔｉｉｔｖｅ　ＥＬＩＳＡ，ＭＬＣ．ＥＬＩＳＡ）。Ｋｗｅｏｎ等【９］以病毒包膜　糖蛋白作为诊断抗原检测抗水泡性口膜炎病毒（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ，ｖＳｖ）中和抗体，采用ＶＳＶ包膜糖蛋白　阳性的马血清和阴性的牛血清分别对ＭＬＩ—ＥＬＩＳＡ、ＭＬＣ—　ＥＬＩＳＡ和当前称为金标准的Ｃ—ＥＬＩＳＡ这３种检测方法的　诊断效能进行了比较研究，结果发现ＭＬＩ—ＥＬＩＳＡ和ＭＬＣ—　ＥＬＩＳＡ相对灵敏度分别为８０％（１６／２０）和９５％（１９／２０），　相对特异性分别为９７％（１７８／１８３）和９９％（３１１／３１４），初　步说明ＭＬＣ—ＥＬＩＳＡ比ＭＬＩ—ＥＬＩＳＡ相对更灵敏、更特异，　另外，与传统的Ｃ—ＥＬＩＳＡ相比，ＭＬＣ—ＥＬＩＳＡ诊断的抗原　表位更特异，可以用来诊断ｖＳｖ感染或评估其疫苗的体液　免疫反应。　２．２中和组织培养酶免疫测定法　虽然ＰＲＮＴ是检测和定量已接种牛痘疫苗者体内中和　抗体的金标准，但是比较耗时、耗力，不适合大规模筛查。　２００５年，Ｅｙａｌ等【１　ｕ＿提出了一个简单、灵敏、标准、可重复　性高且快速的可用于定量检测抗牛痘病毒中和抗体的中和　组织培养酶免疫测定法（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｉｔｓｓｕｅ．ｃｕｌｔｕｒｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＮＴＣ—ＥＩＡ），该方法的主要步骤为：将牛痘病　毒与连续不同稀释度的血清中和，再感染敏感细胞，最后用　ＥＬＩＳＡ方法测定残余病毒，ＮＴＣ—ＥＩＡ与传统的ＰＲＮＴ测　量的病毒平均滴度高度相关（，２＝０．９９９４），该方法灵敏度非　常高（检测界限为１０　ｐｆｕ），既可以用于病毒滴定，也可以　用来评价疫苗接种后血清中的中和抗体和各种血清样本中　的抗病毒复合物（最低检测极限为１：２０）。这种在细胞中进　行的微量中和试验被用于其他病毒中和抗体的检测也有相　关报道＿ｌ　。另外，ＮＴＣ—ＥＩＡ还具有一个显著优势，就是可　以评价并不产生细胞病变效应的病毒滴度及其中和抗体。如　果结合合适的方案使ＮＴＣ—ＥＩＡ实现完全自动化，与ＰＲＮＴ　相比，可减少一半的时间，而且能客观判定结果，具有较好　的费用．效益并且省力，所有这些特点都表明ＮＴＣ—ＥＩＡ很　适用于大规模筛查。　２．３酶联免疫斑点　酶联免疫斑点（ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ，ＥＬＩＳＰＯＴ）　是通过检测分泌特异性抗体的细胞以评价中和抗体水平的　方法。在国内，该方法主要用于疫苗研究，尤其是艾滋病疫　苗。Ａｂａｉ等【】　用非常敏感的免疫组织化学染色法取代免疫　荧光染色法，建立了适合大量评估ＨＣＭＶ疫苗临床试验的　种方便、敏感、特异的微量中和试验方法，他们通过应用　维普资讯 http://www.cqvip.com ３７６　中国医药生物技术２００８年１０月第３卷第５期　ＣｈｉｎＭｅｄＢｉｏｔｅｃｌｍｏｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２００８，Ｖｏ１．３，Ｎｏ．５　自动化的ＥＬＩＳＰＯＴ分析仪器，不仅能很方便地计算出染色　的细胞核而且不易犯人为错误，更加客观，试验结果表明，　提高病毒载量可提高实验数据曲线拟合度、准确度和敏感　度，尤其是对于评价具有少量中和抗体的血清至关重要。而　在检测ＳＡＲＳ冠状病毒的中和试验中，ＥＬＩＳＰＯＴ分析仪器　可以计算所有感染假病毒的细胞ｎ３１。　３抗原一抗体间接凝集抑制试验　在凝集试验中，若先将抗原与抗体混合，隔一定时间后　再加入抗原致敏颗粒，此时，因抗体己与先加入的抗原结合，　不能再与致敏颗粒结合，因此不会出现凝集现象，此即间　接凝集抑制试验。最近，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ等Ｉｌ　］为了比较用于　检测抗流感病毒中和抗体的ＨＩ试验和病毒中和（ｖｉｒｕｓ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉ０ｎ，ＶＮ）试验的可重复性，分别用这２种方法　对８个国家ｌ１个实验室的参与者血清进行了检测，总体　而言，同一实验室内用ＨＩ测定的抗体滴度基本一致，ＶＮ　测得的抗体滴度则有显著的变异性，而ＶＮ可以检测到较　低水平的抗体，敏感性优于ＨＩ；另外，应用ＨＩ判定特异　性抗体滴度较省时，但是灵敏度不高，并且必须采用新鲜的　血细胞才可行。抑制血凝反应的不都是特异性抗体，反之亦　然，不是所有的抗病毒中和性抗体都能抑制血凝作用，因此，　评价抗体的保护效能，测定中和后的病毒活性或合并测定血　凝抑制活性比单纯的血凝抑制试验更准确、更实用。　４新技术在疫苗中和抗体检测中的应用　２００６年，Ｋｏｌｏｋｏｌｔｓｏｖ等【１５】报道了２种基于假病毒的　检测抗委内瑞拉脑炎病毒（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ　ｅｑｕｉｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ，ＶＥＥＶ）中和抗体的新方法：一种是检测标记基因的　表达，尤其适合高效筛选；另一种是一种新的快速的病毒进　入测定法。这种方法主要是对病毒与细胞膜融合时释放入细　胞的病毒荧光素酶进行实时检测，在病毒与细胞接触后　１５　ｍｉｎ内就可以检测到相应信号【ｌ　。为了研究假病毒的可　适用性，Ｋｏｌｏｋｏｌｔｓｏｖ等【ｌ　５１进一步比较了运用活病毒的　ＰＲＮＴ和假病毒试验方法，总体而言，２种方法检测结果很　接近，经ＰＲＮＴ判定为阳性的血清样本，假病毒试验也均　判定为阳性。这种实时检测系统为中和试验提供了一种快　速、合理的检测方法。　目前，对ＨＰＶ疫苗免疫抗体保护效果的评估方法都存　在着操作复杂、效率低、试验周期长或不能直接反映抗体的　中和保护作用等缺点。有研究显示，利用ＨＰＶ　ＶＬＰ可非特　异性包裹质粒核酸的特点构建ＨＰＶ假病毒是体外模拟　ＨＰＶ感染的一种有效方法，ＨＰＶ１６假病毒中和试验具有快　速高效、低成本和易于检测的优点，适于较大规模的应用，　为ＨＰＶ１６中和性单克隆抗体检测及候选疫苗免疫保护效　果的快速准确鉴定提供了有效手段Ｉ”Ｊ。　５展望　目前而言，很多检测中和抗体的方法都是采用完全具有　传染性的病毒，此类方法主要有以下２个显著的缺点：①　在细胞培养的传代过程中容易发生抗原漂移，所以难以控制　实验要求的标准病毒量；②活病毒都具有危险性。而运用假　病毒的检测方法既安全又灵敏，假病毒可以通过质粒转染快　速制备，在一８Ｏ℃能保存３年且可以克服抗原漂移。总　之，假病毒试验非常适合快速、高效筛查相关病毒，但是对　于病毒株或各个亚型抗体的鉴别则还需用传统的ＰＲＮＴ和　其他试验进一步证实。　尽管目前体外试验尚不能彻底代替体内攻击试验，但是　随着研究的不断深入和单克隆抗体的出现，体外试验必将更　具特异性、更标准化。现今，单克隆抗体介导的体外试验尚　不完善，推进中和性单克隆抗体和疫苗的研究进程则要求在　体外准确计量中和抗体的中和水平，以评价抗体和疫苗在实　验动物及人体内的保护效果，所以传统的中和试验技术必须　加以改进才能满足日益进展的理论研究的需要。　参考文献　【１］Ｗａｎｇ　Ｓ，Ｓａｋｈａｔｓｋｙｙ　ＣｈｏｕＴＨ，ｅｔａ１．Ａｓｓａｙｓｆｏｒｔｈｅ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｃｔｉｖｉｉｔｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｓｅｖｅｒｅ　Ａｃｕｔｅ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＡＲＳ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ｓｃｖ）．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２００５，３０１（１／２）：２１－３０．　【２］　Ｂｏｒｇｅｓ　ＭＢ，Ｋａｔｏ　ＳＥ，Ｄａｍａｓｏ　ＣＲ，ｅｔ　ａ１．Ａｃｃｕｒａｃｙ　ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｑｕｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｎｅｕｔｒｌａｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｏｆｒ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｎａｔｉｂｏｄｉｅｓ．　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２００８，３６（２）：１０５—１１０．　【３］Ｚｉｅｌｉｎｓｋａ　Ｅ，Ｌｉｕ　Ｄ，Ｗｕ　Ｈ　ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ａｓｓａｙ　ｏｆｒ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉｌａ　ｖｉｒｕｓ　ｂｙ　ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｐｌａｑｕｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｉｍａｇｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｖｉｒｏｌ　Ｊ，２００５，２：８４．　【４】Ｖｅｎｅ　Ｓ，Ｈａｇｌｕｎｄ　Ｍ，Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｆｔｅｒ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｔｃｋ－ｂｏｒｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｉｔｓ　ｉｎ　Ｓｗｅｄｅｎ．　Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７，２５（２）：３６６—３７２．　［５］Ｋｈａｗｐｌｏｄ　ＩｎｏｕｅＫ，ＳｈｏｊｉＹ　ｅｔａ１．Ａ　ｎｏｖｅｌｒａｐｉｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｆｏｃｕｓ　ｉｎｈｉｂｉｉｔｏｎ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ　ａ　ｇｒｅｅｎ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，１２５（１）：　３５．４０．　【６】Ｗａｎｇ　Ｚ，Ｍｏ　Ｃ，Ｋｅｍｂｌｅ　Ｇ　ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｌｌ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　ｆｌｕｏｌｅｓｃｅｎｃｅ．ｂａｓｅｄ　ｓａｓａｙ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ　ｓｗａｉｎｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｇｒｅｅｎ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，１２０（２）：２０７—２１５．　【７］Ｓｏｎｇ　ＪＭ，ＳｕｎＸＬ，ＷａｎｇＹＬ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｄ￣ｆｌｙ　ａｓｓｅｓｓｉｎｇ　ｈｔｅ　ｉｍｍｕｎｅ—ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＨＰＶ１６Ｌ１　ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｉｍｍｔｍｏｌ，　２００２，１８（３）：１６９—１７１．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　宋建明，孙向乐，王一理，等．一种直接评价ＨＰＶ１６Ｌ１抗体活性　的新方法．中国免疫学杂志，２００２，ｌ８（３）：１６９—１７１．　【８］　Ｍｕｈａｍｕｄａ　Ｋ，　Ｍａｄｈｕｓｕｄａｎａ　ＳＮ，　Ｒａｖｉ　Ｖ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉ０ｎ　ｏｆ　ａ　ｃｏｍｐｅｔｉｉｔｖｅ　ＥＬＩＳＡ　ｆｏｒ　ｅｓｉｔｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｂｉｅｓ　ｎｅｕｔｒｌａｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｏｓｔ－ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｒａｂｉｅｓ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２００７，１１（５）：４４１－４４５．　【９］　Ｋｗｅｏｎ　ＣＨ，Ｋｗｏｎ　ＢＪ，Ｋｉｍ　ＩＪ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ｎａｔｉｂｏｄｙ．１ｉｎｋｅｄ　ＥＬＩＳＡ　ｏｆｒ　ｓｅｒｏ．．ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｉｔｓ　ｖｉｒｕｓ　ｆＶＳＶ－ＩＮ）ｕｓｎｉｇ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｄｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２００５，１３０（１／２）：７—１４．　［１０】Ｅｙａｌ　Ｏ，Ｏｌｓｈｅｖｓｋｙ　Ｕ，Ｌｕｓｔｉｇ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｉｔｓｓｕｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ－　ｂａｓｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ·－ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ·－　ｖａｃｃｉｎｉａ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ｎａｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　８ｅｒａ．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，　维普资讯 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中国医药生物技术２００８年１Ｏ月第３卷第５期　ＣｈｉｎＭｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２００８，Ｖｏ１．３，Ｎｏ．５　３７７　１３０（１／２１：１５—２１．　［１　１］Ｔｉｎｇ　ＳＨ，Ｓｅｅ　Ｅ，１　ＨＣ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｓｉｍｐｌｉｉｅｄ　ａｓｓａｙ　ｆｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ．　［１５］Ｋｏｌｏｋｏｌｔｓｏｖ　ＡＡ，Ｗａｎｇ　Ｅ，Ｃｏｌｐｉｔｔｓ　ＴＩＶｌ，ｅｔ　ａ１．Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｐｅｒｍｉｔ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｄ　ａｅｑｕｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ　ｅｑｕｉｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｔｒｏｐ　Ｍｅｄ　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０ｏ１，９３（１，２）：４３—４７．　Ｈｙｇ，２００６，７５（４）：７０２—７０９．　［１６】Ｋｏｌｏｋｏｌｔｓｏｖ　ＡＡ，Ｄａｖｅｙ　ＲＡ．Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｅｎｔｒｙ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ—ｂａｓｅｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ··ｍｉｘｉｎｇ　［１２】Ａｂａｌ　ＡＭ，Ｓｍｉｔｈ　ＬＲ，Ｗ１ｏｃｈ　ＭＫ．Ｎｏｖｅｌ　ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ＨＣＭＶ　ｕｓｉｎｇ　ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｄａｔａ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７．３２２（１／２）：８２·９３．　［１３】Ｈａｒｔ　ＤＲ　Ｋｉｍ　ＨＧ　Ｋｉｍ　ＹＢ，ｅｔ　１．Ｄｅｖｅｌａｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｓａｆｅ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ＳＡＲＳ—ＣｏＶ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ—ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ａｓｓａ￣Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２００４，７８（１０）：５１２４—５１３２．　［１７１　Ｌｕ　ＷＸ，Ｃｈｅｎｇ　Ｌ　Ｌｉ　ＳＷ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅｌ６　ｐｓｅｕｄｏｖｉｉｒｏｎｓ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａ￣　２ｏｏ４．３２６（１）：１４０—１４９．　［１４］Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ　Ｉ，Ｄａｓ　ＲＧ　Ｗｏｏｄ　ＪＭ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｓｓａｙｓ　ｏｒｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｔｉａｂｏｄｙ　ｔｏ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ／Ｈ３Ｎ２　ｖｉｒｕｓｅｓ　Ｃｈｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，２２（６）：９９０—９９５．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　卢五迅．程通，李少伟，等．人乳头瘤病毒１６型假病毒中和实验的　建立和初步应用．生物工程学报，２００６，２２（６）：９９０．９９５．　ａｌｌ　ｉｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｉｌ曲ｏｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００７．２５（２０）：４０５６－４Ｏ６３．　·信息站点·　“十一五”国家科技支撑计划重点项目“实验室生物安全　关键技术和标准的研究”课题评审会在北京召开　受卫生部科教司委托，生物中心于９月８日在北京铁道大厦组织召开了“十一五”国家科技支撑计划重点项目“实验　室生物安全关键技术和标准的研究”课题评审会。　会议邀请国内从事生物安全、检验检疫等研究领域的９名专家对通过形式审查的所有课题进行了会议评审。本次评审　根据指南内容涉及实验室空气污染防护、实验室感染性污水安全输送、实验室污染空气实时监测、实验室实时监控网络、实　验室污染物泄漏以及实验室外环境样本采集等六个研究方向。　本次课题评审采取会议答辩的方式进行，课题申请人向评审专家组口头陈述申请课题的相关内容，接受专家组质疑并回　答和解释专家提出的问题。　《国家重点实验室建设与运行管理办法》发布　２００８年８月２９日科技部、财政部联合发布了《国家重点实验室建设与运行管理办法》。１９８４年国家重点实验室计划　开始组织实施，现已有国家重点实验室２２０个，固定人员１万余人，仪器设备总值８０多亿元。在统筹部署、适度新建、　定期评估、择优支持、动态管理等创新制度的推动下，国家重点实验室已经成为我国组织开展高水平基础研究和前沿技术研　究、聚集和培养优秀科学家、开展学术交流的重要基地，在科学前沿探索和解决国家重大需求问题方面均做出了突出贡献。　并且原来的《国家重点实验室建设与管理暂行办法》（２００２年）已执行６年，得到了科技界的广泛认同，对规范国家重点　实验室的建设和运行管理发挥了重要作用。　中国正式成立国家生物产业发展专家咨询委员会　为落实国务院批准的《生物产业发展“十一五”规划》，加强对中国生物产业领域重大问题研究，准确把握中国生物产　业发展趋势，提高决策的科学性，更好地推进中国生物产业发展，国家发展改革委员会于２００８年８月５日，在京召开了　国家生物产业发展专家咨询委员会成立大会，宣布了第１届专家咨询委员会组成人员名单，并向专家咨询委员会专家颁发　了聘书。