PRRSV变异株的分离鉴定及生物学特性的研究

PRRSV变异株的分离鉴定及生物学特性的研究

姓名：杨德康申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：王桂军;魏建忠

20090601

摘要２００６年６月以来，安徽省部分地区及周边省市猪暴发了以发热、厌食、眼结膜炎等为主要症状，以高热、高发病率、高死亡率为主要特征的猪急性传染病，即所谓的“猪高热病”。通过血清学和分子生物学检测表明，发病猪多为双重或三重以上感染，常见的混合感染病原为猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、圆环病毒２型、伪狂犬病、链球菌等。病因调查结果显示，这次“猪高热病”流行是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）变异株引起高致病性蓝耳病。为追溯“猪高热病”猪群中ＰＲＲＳＶ流行毒株的来源和变异原因，探索“猪高热病”预防与控制措施，本研究对２００７－＇－－２００８年间分离的ＰＲＲＳＶ流行毒株进行了鉴定、主要基因序列测定、致病性试验，分析了我省ＰＲＲＳＶ流行株与国内外己发表的其它毒株间的遗传变异关系。研究结果为探索我省“高热病”猪群中ＰＲＲＳＶ流行株的来源、分子流行病学和变异情况等提供科学依据，为“猪高热病”的诊断和防制奠定理论基础。１．将采自舒城、定远、肥西、宿州、黄山等县市的不同猪场持续发热的６０份发病猪的肺脏、脾和淋巴结等组织病料用ＲＴ－ＰＣＲ进行ＰＲＲＳＶ检测，筛选阳性样品经处理后接种到Ｍａｒｃ－１４５细胞，能产生明显的细胞病变，电镜观察可见直径５０—８０ｎｍ的有囊膜病毒粒子，与美洲型ＰＲＲＳＶ阳性血清进行间接免疫荧光试验可见特征性荧光；ＲＴ－ＰＣＲ检测可见目的条带，证实分离的５株病毒为ＰＲＲＳＶ，分别命名ＳＣＨ０７、ＤＹ０７、ＦＸ０７、ＳＺＨ０８、ＨＳＨ０８。２．对５株ＰＲＲＳＶ的Ｎｓｐ２高变区和ＯＲＦ５测定和序列分析结果表明，所有分离株的Ｎｓｐ２都发生３０个氨基酸的不连续缺失，缺失位置与ＪＸＡＩ株完全一致；５株流行株之间Ｎｓｐ２基因高变区核苷酸同源性在９７．１％＂－＇９８．７％之间，ＯＲＦ５全基因的核苷酸同源性在９６．９％～９９．７％之间。根据Ｎｓｐ２基因高变区、ＯＲＦ５全基因的核苷酸同源性，与２００６年后的新分离株尤其是ＨｕＢｌ株同源性最高，核苷酸同源性分别在９６．８％以上。根据Ｎｓｐ２基因高变区、ＯＲＦ５全基因所建立的遗传系统发育树可知这５株ＰＲＲＳＶ流行株之间的亲缘关系很近，与江西、湖北等２省的ＰＲＲＳＶ流行株由同一毒株演化而来，同属美洲型。３．选取ＳＣＨ０７毒株的第１５代细胞培养物经Ｒｅｅｄ．Ｍｕｅｎｃｈ法测定毒价为１０４一ＴＣＩＤ５ｄｏ．１ｍＬ。按５ｍＬ／头经口、鼻接种ＰＲＲＳＶ抗原与抗体均为阴性的健康猪２头，并设阴性对照组。通过测量体温、临床症状、大体病变、病理切片观察、ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ抗体检测等方法分析其病毒致病性。结果表明：接种病毒猪出现高热、呼吸障碍等典型“猪高热病”的临床症状，试验猪剖检均出现以心叶、尖叶为主的灶性暗红色实变为特征的肺脏病变；病理切片显示了间质性肺炎等符合猪繁殖与呼吸综合征的病理变化，ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ抗体检测均为阳性。证实了分离的病毒为ＰＲＲＳＶ变异株，其中接毒组有一头猪死亡，说明ＰＲＲＳＶ变异株的致病力增强。也佐证了ＰＲＲＳＶ变异株是“猪高热病”的主要病原之一。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；变异株；分离鉴定；序列分析：致病性ＡｂｓｔｒａｃｔＡｓｅｖｅｒｅｐｉｇｄｉｓｅａｓｅｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ“ｈｉｇｈｆｅｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ”，ｗｈｉｃｈｓｐｒｅａｄｍｏｒｅｔｈａｎ２０ｐｒｏｖｉｎｃｅｓｉｎＣｈｉｎａｉｎ２００６，ｃａｕｓｅｄｇｒｅａｔｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄｔｈｅｃｏｌｏｒｉｎｔｈｅｉｎｆｒｉｎｇｅｄｏｒａｐｉｇｓｃｏｍｍｏｎｃｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓｓｕｃｈａｓｏｆｔｈｅｒｅｄｄｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅｓｋｉｎｐｕｒｐｌｅｅａｒｓ，ｅｄｅｍａｅｙｅｌｉｄｓ，ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓａｎｄｅｘｔｅｎｓｉｖｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｉｎｐｒｅ－ｗｅａｎｉｎｇｐｉｇｌｅｔｓｗｉｔｈｈｉｇｈｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｃｔｈａｔ５ａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅａｎｄｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳⅥｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｔｅｓｔｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｉｍａｌｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓｕｇｇｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｆｅｌｌｉｎｔｏｔｈｅｖａｒｉａｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＰＲＲＳＶｗｉｔｈｖｅｒｙｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．６０ｓｕｓｐｅｃｔｓａｍｐｌｅｓｏｆｌｕｎｇ，ｓｐｌｅｅｎａｎｄｌｙｍｐｈｎｏｄｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｆｅｃｔｅｄｈｅｒｄｓｉｎＡｎｈｕｉｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｆｉｖｅｓｕｓｐｅｃｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＰＲＲＳＶｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅＰＣＲｐｏｓｉｔｉｖｅｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｇｒｅｗｗｅｌｌａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）ｏｎＭａｒｃ一１４５ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｓｅｒｉａｌｏｆｐａｓｓａｇｅｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｓｈｏｗｅｄｔｈｅｖｉｒｉｏｎｉｓｅｎｖｅｌｏｐｅｄｗｉｔｈｔｈｅｄｉａｍｅｔｅｒｏｆａｂｏｕｔ５０—８０ｎｍ．ＡｌｌｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓＣａｎｒｅａｃｔｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｗｉｔｈｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒｕｍａｇａｉｎｓｔｓｔａｎｄａｒｄｓｔｒａｉｎｏｆＰＲＲＳＶＶＲ一２３３２ｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ（ＩＦＡ）ａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｏｒｖａｒｉａｎｔｏｆＰＲＲＳＶｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｂｙＲＴ－ＰＣＲ．ＯｕｒｄａｔａｓｕｐｐｏｒｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｂｅｌｏｎｇｔｏｖａｒｉａｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＰＲＲＳＶｗｈｉｃｈｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＳＣＨ０７，ＤＹ０７，ＦＸ０７，ＳＺＨ０８ａｎｄＨＳＨ０８ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＰＲＲＳＶｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｏｒｉｇｉｎｓｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎｔｙｐｅａｎｄＮｏｒｔｈａｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏ２ｍａｊｏｒｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅ．Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｓｐｒｏｔｅｉｎ２（Ｎｓｐ２）ａｎｄｄｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ５（ｅｎｃｏｄｅｄｂｙＯＲＦ５）ａｌｅｒｅｇａｒｄｅｄｔｈａｔａｒｅ２ｒｅｇｉｏｎｓｏｆｈｉｇｈｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＰＲＲＳＶｓｔｒａｉｎｓ．ＰａｒｔｉａｌＮｓｐ２ａｎｄＯＲＦ５ｇｅｎｅｓｏｆｆｉｖｅｉｓｏｌａｔｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲａｎｄｖｅｃｔｏｒｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＭＤＩ８一Ｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔ５ＰＲＲＳＶｉｓｏｌａｔｅｓｓｈａｒｅｄ９７．１％＇－＇９８．７％ｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆＮｓｐ２ｔｈａｎａｎｄ９６．９％～９８．７％ｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆＯＲＦ５，ｓｈａｒｅｄｍｏｒｅ９６．９％～９９．７％ｈｏｍｏｌｏｇｙＨｕＢＩ，ＨｕＮ４ａｎｄＪＸＡＩｓｔｒａｉｎｓ，ｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｙｂｅｌｏｎｇｔｏＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅ．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｌｌｔｈｅＰＲＲＳＶｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｆｅｃｔｅｄｐｉｇｓｉｎａｔｈｉｓｏｕｔｂｒｅａｋｏｆ‘＇ｈｉｇｈｆｅｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ＇’ｓｈａｒｅｉｎＮｓｐ２ｇｅｎｅ，ｗｈｉｃｈｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆ３０ａｍｉｎｏａｃｉｄｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＰＲＲＳＶｉｎｐｉｇｓ．ＩＩＩＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＰＲＲＳＶｉｓｏｌａｔｅｓ，ａｎｉｍａｌｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｔｅｓｔｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．Ｆｏｕｒ４０－ｄａｙ－ｏｌｄｐｉｇｓｗｉｔｈａｎｔｉｂｏｄｙｎｅｇａｔｉｖｅｏｆＰＲＲＳＶｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ２ｇｒｏｕｐｓ，２ｐｉｇｓｉｎｔｅｓｔｇｒｏｕｐｗｅｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｗｉｔｈＳＣＨ０７ｉｓｏｌａｔｅｓｔｒａｉｎｗｉｔｈＴＣＩＤ５０ｏｆｌ０４’７／０．１ｍｌ，ａｎｄａｎｏｔｈｅｒ２ｐｉｇｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎａｓｃｏｎｔｒ０１．Ａｔ３－４ｄａｙｓｐｏｓｔ—ｃｈａｌｌｅｎｇｅ，ｔｈｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｐｉｇｓｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄｓｅｒｉｏｕｓｓｉｇｎｓｏｆ“ｈｉｇｈｆｅｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ”ｗｉｍｈｉｇｈｂｏｄｙｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，ａｎｏｒｅｘｉａ，ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓｂｌａｎｃｈｉｎｇｒａｓｈｉｎｅａｒｓ，ａｎｄｎｅｒｖｏｕｓｓｙｍｐｔｏｍａｎｄｄｉｅｄａｔｄａｙ１５ｐｏｓｔ—ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄａｎｄＴｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｇｒｏｓｓｌｅｓｉｏｎｏｆｅｘｔｅｎｓｉｖｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｉｎｌｕｎｇ，ｓｐｌｅｅｎ，ｌｙｍｐｈｎｏｄｅｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄＰＲＲＳＶｉｓｏｌａｔｅＳＣＨ０７．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｈｉｓｔｏｌｏｇｙｐｉｇｓｗｉｔｈｓｈｏｗｅｄｔｙｐｉｃａｌｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｐｕｌｍｏｎｉｔｉｓ，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｐａｒｓｅｎｅｓｓａｎｄｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｏｆｇｒｏｉｎ，ｗｈｉｃｈＷａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｍａｔｏｆｓｔｒａｉｎｓ．ＯｕｒｄａｔａｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｖａｒｉａｎｔｓｔｒａｉｎｏｆＰＲＲＳＶＨｕＢ１，ＨｕＮ４ａｎｄＪＸＡＩｉｄｅｎｔｉｃａｌｖａｒｉａｎｔｓｏｆＰＲＲＳＶａｌｅｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅｅｐｉｄｅｍｉｃｏｆ“ｈｉｇｈｆｅｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ＇’ｉｎＡｎｈｕｉｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄ：ＰＲＲＳＶＶａｒｉａｎｔ，ＩｓｏｌａｔｉｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ＩＶ主要缩略语列表ｂｐｂａｓｅｐａｉｒＤＮＡｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅａｃｉｄＲＮ＿ＡｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｃｉｄｃＤＮＡｅｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡＥＤＴＡＥ吐ｌｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｉｄＤＥＰＣｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅＥＢＥｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄＩｔＮ髂ｉＩｌｒｉｂｏｓｏｍｅｎｕｃｌｃｏｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒＯｌ心ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｌａｍｅｇｇｒａｍｈｈｏｕｒｎａｇｍｉｌｌｉｇｒａｍｍＬｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｎｇｎａｎｏｇｒａｍｋＤａｌ（ｉＩｏｄａｌｔｏｎＰＢＳｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎＰＣＲｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＲＴ－ＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｏＤｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙｒ／ｍｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅＳｓｅｃｏｎｄ＂ＩｒｉｓＴｒｉ（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ）ＡｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅＮＣＳｆｅｈａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ．ＵｕｎｉｔＫｂｋｉｌｏ－ｂａｓｅｐａｉｒ烬ｍｉｃｒｏｇｒａｍ此ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒＰＲＲＳＶｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅＨＰＰＲＲＳＶｈｉｇｈｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＰＲＲＳＶＣＳＦＶｃｌａｓｓｉｃａｌＳｗｉｎｅＦｅｖｅｒＰＣＶｐｉｇｃｉｒｅ灯ｖｉｒｕｓＶ碱基对脱氧核糖核酸核糖核酸与ＲＮＡ互补的ＤＮＡ乙二胺四乙酸焦碳酸二乙酸溴化乙锭ｌⅢＡ酶抑制剂开放阅读框克小时毫克毫升纳克千道尔顿磷酸盐缓冲液聚合酶链反应反转录．聚合酶链反应光密度每分钟转数秒三（羟甲基）氨基甲烷胎牛血清国际单位千碱基对微克微升猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性猪繁殖与呼吸综合征病ｉ猪瘟病毒猪圆环病毒独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：ｊ强．２蒸庠酮：沙『：｜吼卧日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：垫生约差帅：砂≯用伸第一导师签名：羔挝垦时间：少＿『“月／／日，文献综述猪繁殖与呼吸综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）ｓｙｎｄｒｏｍｅ是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）引起的一种传染病，以发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍，仔猪和育成猪发生呼吸道症状和高死亡率为特征。１９８７年在美国中西部的北卡罗纳、衣阿华等州首先发现该病【１Ｊ，１９９０年６月德国发现此病，接着在加拿大、日本、西班牙、法国、荷兰、丹麦等国相续爆发。１９９１年Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ等首次分离到病毒【２１，目前该病已在全球范围内传播、蔓延。１９９１年初，中国地区出现ＰＲＲＳｌ３１。１９９６年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所郭宝清等从暴发流产猪的胎儿中分离到ＰＩ汛ｓＶｃｈ．１ａ株。首次证实了该病在我国的存在【４１。此后国内诸多检测结果表明，该病在我国许多地方广泛流行【５，６１。２００６年夏季，我国先从南方数省开始后波及全国大部分省份，很多猪场发生了以高热、呼吸困难、皮肤发红为特征的“猪高热病”。疫情至今仍时有发生，给养猪业造成了严重的经济损失。国内相关单位和学者对病因开展了大量调查和多方面研究，最后证实猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株是本次猪高热病的主要病原之一【７＇８】１．ＰＲＲＳＶ的生物学特性ＰＲＲＳＶ属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属【９１，其同属成员还有ＬＤＶ、ＥＡＶ和ＳＨＦＶ。ＰＲＲＳＶ系有囊膜的不分节段的单股正链ＲＮＡ病毒，电镜观察纯化的病毒粒子呈球形，直径约为４５ｎｍ＇～８０ｎｍ，内有一个呈２０面立体对称的具有电子致密性的核衣壳，其直径为２５ｎｍ，、，３５ｎｌｌｌ，表面上有约５ｎｌｎ的突起。ＰＲＲＳＶ对氯仿、乙醚等脂溶剂和去垢剂敏感。在氯化铯和蔗糖密度梯度中浮密度分别为１．１３ｇ／ｃｌｎ３～１．１９９／ｇｉｎ３和１．１８ｇ／ｃＩｎ３～１．２３ｇ／ｃｎｌ３；温度、湿度和ＰＨ值对ＰＲＲＳＶ的影响较大，低温下保存的ＰＲＲＳＶ具有较好的稳定性，－－２０℃～一７０℃下可长期保存，且病毒活力不发生明显的变化，４℃保存一周病毒活力下降９０％，３７℃其活力可持续３ｈ＇－＇－２４ｈ，５６℃仅持续６ｍｉｎ＇－＇２０ｍｉｎ。潮湿的环境有助于ＰＲＲＳＶ存活，干燥的环境条件下病毒则迅速失活。ＰＨ值在６．５～７．５之间ＰＲＲＳＶ相对比较稳定，超出这个范围其感染力可下降９０％以上。自然分离到的ＰＲＲＳＶ不凝集猪、羊、鸭、鸡、小鼠、豚鼠及人的Ｏ型红细胞ｌｌ们，但经非离子去垢剂和脂溶剂处理后，可凝集小鼠的红细胞。ＰＲＲＳＶ的～个重要生物学特性是具有抗体依赖性增强作用（ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔＡＤＥ），当病毒和抗体结合产生抗原抗体复合物后，借助Ａｂ的Ｆｃ片段与靶细胞的Ｆｃ受体结合，从而促进病毒进入细胞。因此在细胞培养物中加入一定滴度的ＰＲＲＳＶ抗体，可显著提高病毒的含量。ＰＲＲＳＶ具有严格的宿主范围，体外培养生长要求较高，在常用的原代和传代细胞中不能生长，但在原代猪肺泡巨噬细胞（ＰＡＭ）、非洲绿猴肾传代细胞系ＣＬ２６２１、Ｍａｒｃ一１４５细胞及从Ｍａｒｃ．１４５细胞中克隆出的ＨＳ２Ｈ细胞上生长增殖。ＰＲＲＳＶ在ＰＡＭ上适应性强、生长较快，ＣＰＥ出现较早（１ｄ．－一４ｄ）；而在ＣＬ２６２１和Ｍａｒｅ．１４５细胞上生长稍慢，ＣＰＥ／出现较晚（２ｄ－．一６ｄ），ＰＡＭ对大多数ＰＲＲＳＶ毒株都适应，且产毒量大，但因ＰＡＭ制备的技术难度较大，难以获得均质的ＰＡＭ等问题，应用受到一定。因此目前常用Ｍａｒｃ．１４５细胞分离培养ＰＲＲＳＶ【１１１，主要表现为细胞圆缩、聚集，最后崩解脱落。２．病毒基因组结构ＰＲＲＳＶ为不分节段的单股正链ＲＮＡ病毒。基因组长约１５ｋｂ【１２，１３】，基因组含有８个的开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），基因组顺序依次为５，－ＯＲＦｌａ－ＯＲＦＩｂ．ＯＲＦ（２．７）．３’，病毒基因组相邻的各编码框有部分重叠。ＯＲＦｌ包括ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ，长约１２ｋｂ，占基因组的８０％，位于基因组５’端２ｌ１个碱基的非编码前导序列之后，编码病毒依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶。ＯＲＦｌａ编码起始区的核心序列为５＇ＵＡＡＣＣＡＵＧ３’，高度保守。ＯＲＦｌａ编码区有一些疏水区，一个推定的丝氨酸蛋白酶区和半胱氨酸富聚区。ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ重叠１６个核苷酸，在重叠区序列中有庚核苷酸结构（ＵＵＵ八触ｃ）和拟节结构，这两种结构均是聚合酶翻译过程中核糖体移码所必须的。编码框ＯＲＦ２～ＯＲＦ７编码病毒结构蛋白，其中ＯＲＦ２＂－－－ＯＲＦ６编码与病毒膜有关的蛋白，ＯＲＦ７编码病毒核衣壳蛋白。ＯＲＦ７终止密码子之后为３’非编码区，含有一个ｐｏｌｙ（Ａ）尾。在ｐｏｌｙ（Ａ）尾的上游有一个高度保守的８核酸苷序列，这段序列的功能可能是聚合酶的结合区，用以启动负链ＲＮＡ的合成【Ｉ４１。在我国近期发生的高致病性蓝耳病的病毒基因组中，非结构蛋白Ｎｓｐ２基因的第１４４７＂－＂１４４９位和第１５９７＂－＂１６９８位的核苷酸发生了缺失，与我国２００５年以前分离的ＰＲＲＳＶ相比，Ｎｓｐ２基因的同源性仅为６９．８％～８６．２％ｆ１５Ｊ。Ａ＇一卜——————————————————＿．◆●卜——◆ｌａ５’，ＧＰ３ＧＰ５ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ１ｂＧＰ２Ｇ＾Ｍ３’ＮＯＲＦｓ２罔ｌ－ｌ：ＰＲＲＳＶ龌ｌ爿组组成Ｆｉｇｌ—ｌ：ＣｏｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰＲＲＳＶｇｅｎｏｍｅ根据基因纽序列分析，ＰＲＲＳＶ粒子至少应有６种结构蛋白㈣，Ｉ！ＩＩＧＰ２、ＧＰ３ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ蛋白ｆｌＩＮ蛋白（如图２所示），其中ＧＰ５、Ｍ、Ｎ蛋白分别是ｒ｜＿ＩＯＲＦ５ＯＲＦ６、ＯＲＦ７编码的．是ＰＲＲＳＶ的主要结构蛋白。图１－２ＰＲＲＳＶ的病毒粒子Ｆｉｇｌ－２ｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃａｌｏｆＰＲＲＳＶＧＰ２为结构糖蛋白１１７１，由ＯＲＦ２编码．分ｒ篮为２９ｋｕ～３０ｋｕ。是种Ｎ２耱基化蛋白质．通过ｃ端的跨膜区域粘附囊膜上，Ｎ床端的２个糖基化化点４：病毒粒子表面，因此它是ＰＲＲＳＶ的一种结构蚩ｎ。ＧＰ２ａ也可以出现于内质网上，表明ＧＰ２ａ州能足在内质网上纰装后才运输剑岛尔扯体上的。ＧＰ２可被单克隆抗体ＷＢＥ２识别，有两个明显的疏水峰和糖基化他点。ＧＰ２蛋白免疫原性很差，在病毒中含量较少，很难从感染的细胞裂解液或纯化的病毒粒‘ｆ－巾褂到分离箍定Ｉ”ｌ。对该蛋白的免疫学地位尚不明确。ＧＰ３为高度糖基化蛋白【Ｉ”，具有７个糖基化位点，分了量为４０ｋｕ～５０ｋｕ．含２６５个氨璀酸。现在对ＧＰ３是否为结构蛋白尚有争议。ＧＰ３至少包含２个抗原决定簇，１个存在－ｔ：ＧＰ３的Ｎ末端，是较为保守的表位，大多数北美洲型ＰＲＲＳＶ中都含有该表位。ＧＰ３的Ｃ端为高变区，足ＰＲＲＳＶ各毒株间保守性最差的蛋白之一。北美洲型与欧洲型同源率为５４％～６０％，用杆状病毒表达载体表达了ＰＲＲＳＶＯＲＦ３的产物，表达产物可给猜提供６８４％的保护牢，说明ＯＲＦ３表达产物在抵抗病毒感染时具有一定作用。ＧＰ４蛋白是病毒的主要结构蛋白之一，分子艟约为３ｌｋｕ～３５ｋｕ，有４个糖基化位点，其Ｎ端和Ｃ端有高度的疏水区。Ｃ束端有引起病毒科，ｍ的跨膜区域，Ｎ术端外部有糖基化位点。该蛋白氨基端有一信号肚序列，在ＧＰ４蛋白胞外区第４０位～第７９何氨基酸之Ｍ有一个ｕＩ与巾抗发生中和反应的抗原决定簇。虽然ＧＰ４ｉｉ｛Ｆ１具有中和表位，ｆｔ＝ｉ１０ｔ清的中和抗僻＝效价似乎与ＧＰ４抗体的出现无相关性【２０１，因此，ＧＰ４蛋白在诱导中和抗体方面的意义还不十分明确。糖蛋白ＧＰ５也称Ｅ蛋白，由ＯＲＦ５编码，为糖基化的囊膜蛋白，约２００个氨基酸，分子量２６－－－３０ｋＤ。ＧＰ５蛋白含有２＂－－＇４个糖基化位点和一段含３１个氨基酸的信号肽【２¨，在ＰＲＲＳＶ不同分离株间ＧＰ５蛋白的信号肽长度和糖基化位点数目存在差异。欧洲型ＬＶ株ＧＰ５的信号肽为氨基酸１＂一３２，裂解位点为氨基酸３２或３３，而美洲型ＧＰ５的信号肽为氨基酸ｌ～２５；ＬＶ株含有２个糖基化位点【勿，而美洲型ＡＴＣＣＶＲ一２３３２有４个糖基化位点。定点突变试验证明与ＧＰ５的Ｎ４６相连的低聚糖链是病毒粒子形成所必需的，如果丢失该低聚糖链将明显降低病毒的特异感染力。而与Ｎ５３相连的低聚糖则非病毒粒子形成所必需，也不会明显影响病毒的感染性１２３１。ＧＰ５有６个抗原决定簇，可诱导产生中和抗体，能在体外中和病毒的感染性，病毒中和作用与抗ＧＰ５抗体效价呈显著相关性，而且针对ＧＰ５的单抗比ＧＰ４的单抗在中和病毒方面更为有效可靠。用含编码ＧＰ５的质粒ＤＮＡ免疫，可使接种猪产生抗ＧＰ５的特异性中和抗体。Ｓｕａｒｅｚ等【２４】首次报道ＧＰ５可以诱导感染组织或细胞培养物中未感染的周围细胞发生调亡，这种功能与ＧＰ５的前１１９个氨基酸密切相关。缺失突变质粒的体外瞬时表达试验表明，ＧＰ５Ｎ端的１１８个氨基酸对于保持ＧＰ５诱导细胞凋亡的活性必不可少，而缺失其Ｃ端并不影响其活性，但Ｌｅｅ等【２５】的研究结果则认为，ＧＰ５诱导的细胞调亡可能是一种非典型现象Ｍ蛋白，也称基质蛋白，由ＯＲＦ６编码的非糖基化膜蛋白，分子量为１８～１９ｋｕ。ＶＲ２３３２型和Ｌｖ型分别含有１７４和１７３个氨基酸。Ｍ蛋白在所有的ＰＲＲＳＶ株间高度保守，在欧、美型毒株间也最为保守。同其它动脉炎病毒一样，ＰＲＲＳＶＭ蛋白聚集在感染细胞的粗面内质网中，再次与ＧＰ５形成以二硫键相连的异源二聚体，两蛋白Ｎ．端胞外区的半胱氨酸（ｃｙｓ）可能参与分子间二硫键的形成１２６１。在病毒对肺泡巨噬细胞附着和病毒侵染过程中起重要作用【２７１。如果破坏分子间的二硫键可以降低ＰＲＲＳＶ的感染性。应用Ｍ蛋白的单克隆从欧洲和北美洲的分离株中识别出２个共同和１个独特的抗原决定簇【２引。Ｍ蛋白具有很强的免疫原性，感染后１０ｄ就可以检测该抗体应答【２９１。因此，检测Ｍ蛋白的抗体也可以作为ＰＲＲＳＶ感染的诊断与监测指征。由于Ｍ蛋白与其他膜蛋白及其膜功能密切相关，推测Ｍ蛋白在病毒装配和出芽过程中可能有重要作用。Ｎ蛋白由ＯＲＦ７编码的核衣壳蛋白，分子量为１４＂＂１５ｋＤ，是非糖基化蛋白。在欧、美两型毒株间Ｎ蛋白相对比较保守，但其氨基酸数目不同，分别为１２８个和１２３个氨基酸，在病毒粒子中Ｎ蛋白主要以通过二硫键形成同源二聚体形式存在，也可与Ｍ或ＧＰ５形成异源二聚体。Ｌｅｅ等利用反向遗传学技术证明，Ｎ蛋白自身的同源二聚体化，或与其他结构蛋白的异源二聚体化对维持４ＰＲＲＳＶ的感染性很重要【３０１。Ｎ蛋白Ｃ端在维持蛋白质构象上发挥重要作用。其Ｎ端的半段是由Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ三种氨基酸组成，在组装核衣壳蛋白的过程中可能促进Ｎ蛋白和ＲＮＡ基因组的相互结合，这是两种血清型毒株所共有的特点。该蛋白中至少含有５个抗原决定簇，其中有对所有毒株保守的共同决定簇，也有美洲型或欧洲型特异性决定簇，因此可以用Ｎ蛋白的单克隆抗体识别和区分欧洲、美洲型毒株，Ｎ蛋白在病毒粒子中含量较高，约占病毒蛋白总量的２０％～４０％ｔ”】，具有极强的免疫原性。实验表明，感染ＰＲＲＳＶ后约９ｄ～１ｌｄ，机体首先产生针对该蛋白的抗体，中和抗体直到第３周～４周才产生，该抗体最可维持半年以＿ｌＪ３２ｌ，但不具备中和活性。基于此，现在更多地被用于该病诊断方法的研究。３．病毒基因组的遗传与变异现有的基因组学和遗传学证据表明，ＰＲＲＳＶ在ＲＮＡ合成时容易出现内在性错误，ＲＮＡ基因组因点突变、删除、添加和取代而具有很高的突变频率，因此，ＰＲＲＳＶ存在广泛而明显的变异现象，通过对不同地区分离株的序列分析，证实了ＰＲＲＳＶ北美分离株和欧洲分离株之间存在相当高的序列差异性。核苷酸的同源性仅为５５％＇－＂７０％。在非编码区（５ＵＴＲ）和非编码区（ＹＵＴＲ），欧洲型与美洲型毒株的差异很大，二者的５＇ＵＴＲ相似性仅约５０％，其中欧洲型毒株的５ＺＩＴＲ包含２２１～２２３个核苷酸，而美洲型毒株的５＇ＵＴＲ序列包括１９０或１８９个核苷酸。但多数美洲型毒株间的５＇ＵＴＲ序列相对保守，仅有个别碱基的置换或缺失。美洲型毒株的３＇ＵＴＲ比欧洲型毒株的要长，两型毒株３＇ＵＴＲ同源性为５９％，存在个别碱基的置换或缺失【３３Ｊ。此外各毒株的ｐｏｌｙ（Ａ）的数量也可能有差异，或许与病毒复制密切相关【ｊ４。。欧、美型毒株的序列比较显示，ＯＲＦＩ序列的差异也很大，其中ＯＲＦＩａ的变异最为明显，是在ＰＲＲＳＶ的ＯＲＦ中变异最大的一个。美洲型各毒株间的ＯＲＦＩ差异虽然比较小，但ＯＲＦｌａ的变异也相对较大。ＯＲＦＩ中推测的非保守氨基酸的改变主要集中在ＮｓｐＩｆｌ和Ｎｓｐ２，Ｎｓｐ２为各毒株间差异较大的的一个编码区，具有种特异性，与ＰＲＲＳＶ对细胞或组织的嗜性有关，也可能与毒株的致病性有关，在遗传关系很近的毒株间也可有较大差异，已发现源于ＶＲ．２３３２的疫苗株的Ｎｓｐ２靠近Ｃ端的高变区有３６个氨基酸的插入，此外还有１５８个氨基酸的置换。２００４年，高志强等发现了ＯＲＦｌａ的Ｎｓｐ２编码区存在连续３６个核苷酸的缺矢，这是国内外首次发现ＰＲＲＳＶＮｓｐ２编码区存在缺矢变异现象【３５１。此后，田克恭等也发现了２００６＂－＇２００８年我国南方爆发的高致病性猪蓝耳病也是由ｎｓｐ２的第４８２位缺失１个氨基酸和在第５３４位至第５６２位有２９个氨基酸缺失的变异株引５起的。在结构蛋白编码区ＯＲＦ２ａ～ｏＩ强７中，ＯＲＦ３和ＯＲＦ５是结构蛋白编码区保守性最差的蛋白质的２个开放性可读框，ＧＰ３在欧、美型毒株间推导氨基酸的同源率为５４％－－一６０％。而ＧＰ３的Ｎ一端潜在的糖基化位点及疏水性是保守的Ｉ３６１。另外，同ＬＶ相比，美洲型毒株的ＧＰ３中Ｃ．端的推导氨基酸有１２个残基的缺失。同型毒株ＧＰ５推导氨基酸序列相似性在８８％＂－－９９％之吲３７１。而欧、美型毒株ＧＰ５推导氨基酸的同源率在５２％－－一５５％之间【３８】，此差异己相当于它们与ＬＤＶ的差异。２００６年以来，我国的ＰＲＲＳＶ的流行株之间ＧＰ５的同源性在９３％＇－－１００％之间【３９１。欧、美型毒株ＯＲＦ６最为保守，同源率在７８％＇－－＇８１％。而同型毒株ＯＲＦ６推导氨基酸的相似性在９６％以上。ＯＲＦ７也是非常保守的，美洲型毒株间ＯＲＦ７推导氨基酸序列的同源率在９６％－－一１００％［４０１，而欧洲型毒株间同源率在９４％～９９％，但将美洲型毒株与欧洲型毒株ＬＶ比较时，ＯＲＦ７的核酸序列与推导氨基酸同源率分别为６３％和５９％，此差异是由大量核苷酸的置换、插入和缺失造成的。４．ＰＲＲＳＶ的诊断方法４．１病毒分离病毒的分离与鉴定是传统的，也是最可靠的确诊方法，ＰＲＲＳＶ分离的成功率受发病猪群的发病时期、生长阶段、采样部位的影响。通常在发病猪群的急性感染期，采取死胎的脾和淋巴结、仔猪的肺脏、其他猪可采取肺、脾、扁桃体等组织。母猪还可采取血清和血浆。采取上述组织的匀浆混合物，接种敏感细胞如ＰＡＭｓ、ＣＬ２６２１、Ｍａｒｃ．１４５等，细胞出现病变效应（ＣＰＥ），表明病毒分离阳性。但有些毒株只能在ＰＡＭｓ或ＣＬ２６２１其中的一种细胞上复制【４１１，在进行病毒分离可用多种细胞系来进行病毒的分离培养。４．２血清学诊断ＰＲＲＳ诊断的血清学方法也是目前诊断该病最为广泛的方法。目前已建立的可用于检测ＰＲＲＳ的血清学方法主要有间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）、免疫过氧化物酶单层试验（ＩＰＭＡ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、血清中和试验（ＳＮＴ）等四种。其中ＩＦＡ、ＳＶＮ和ＥＬＩＳＡ在美洲诊断实验室应用较多，而欧洲主要用ＩＰＭＡ检测ＰＲＲＳＶ抗体。４．２．１酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）ＥＬＩＳＡ是广泛用于ＰＲＲＳ诊断的一种方法，主要用于ＰＲＲＳ抗体检测。由于ＥＬＩＳＡ具有很好的特异性和灵敏度，对于早期抗体的检测比用ＩＰＭＡ更为敏感。国内外学者对此进行了深入的研究，建立了很多检测ＰＲＲＳ的ＥＬＩＳＡ方法，如间接ＥＬＩＳＡ、捕捉ＥＬＩＳＡ、阻断ＥＬＩＳＡ、夹心ＥＬＩＳＡ等。同时也研制出多种商品化的试剂盒。美国ＩＤＥＸＸ公司的商品化ＥＬＩＳＡ试剂盒检测的特异性能达到９８％～９９％，Ｄｅａ等Ｈ２］建立的竞争性酶６联免疫吸附试验，对人工感染猪检测表明．其特异性和敏感性分别达到１００％和９６％。４．２．２免疫过氧化物酶单层细胞试验（ｍＭＡ）ＩＰＭＡ具备高特异性和敏感性其敏感性要比ＥＬＩＳＡ高。ＩＰＭＡ经常用于感染后７ｄ～１５ｄ，ＰＲＲＳＶ的检测。与ＩＦＡ一样，ＩＰＭＡ同样在感染后２个～３个月检测比较可靠。这种于１９９１年建立的ＰＲＲＳＶ血清抗体检测法，至今仍是欧美国家广泛使用的血清学诊断方法。１９９６年我国等【４３】报道首次在国内成功建立了ＩＰＭＡ检测ＰＲＲＳ抗体的方法，谭斌１４４１等建立一种检测ＰＲＲＳＶ血清抗ＩＰＭＡ，并组装成ＰＲＲＳＶ．ＩＰＭＡ抗体检测试剂盒，检测临床中的血清样本，与ＩＤＥＸＸＥＬＩＳＡ试剂盒的符合率为８３．３％。４．２．３间接荧光抗体（ＩＦＡ）技术ＩＦＡ是Ｙｏｏｎ等【４５ｌ于１９９２年首次报道建立的。可以用ＰＡＭ、ＣＬ－２６２１、ＭＡＲＣ．１４５细胞培养物进行实验。特异性和敏感性都较好，可以在感染后２～３周检测出抗体，成为欧美各国官方认可的权威检测方法。郭宝清等１９９６年应用ＩＦＡ对国内１５ｌ份血清样品进行检测，阳性率为５８．６％，证实了我国猪群存在ＰＲＲＳＶ感染。孙颖杰等１９９７年报道用９６孔微量板作为载体，建立了检测ＰＲＲＳ抗体的微量ＩＦＡ，与传统的玻片ＩＦＡ比较，不仅特异性与敏感性相同，而且降低了试验成本，减化了制备程序。彭长凌等ｍ】应用ＰＲＲＳＶ保守的核衣壳蛋白（Ｎ蛋白）的单克隆抗体为一抗，用荧光标记抗体法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＦＡＴ）对ＰＲＲＳＶ人工感染猪和ＰＲＲＳ疑似猪的肺组织进行抗原检测，取得预期结果，提高了ＩＦＡ检测结果的准确性和可靠性。４．２．４病毒中和试验ＳＮ具有高度特异性，但由于中和抗体在感染后产生时间较迟，但其敏感性不如ＥＬＩＳＡ。不适用于ＰＲＲＳ早期诊断。ＳＮ只能说是一种较好的研究方法，它非常费时费力，不适用于日常的ＰＲＲＳＶ诊断，但在所有血清学检测方法中，此法是评价猪群的免疫保护水平的惟一客观可信的方法。４．３分子生物学检测法４．３．１ＲＴ．ＰＣＲ法ＰＣＲ相关技术有着较高的特异性和敏感性，已广泛应用于ＰＲＲＳＶ的鉴定及临床诊断。国外Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ等建立了ＴａｑＭａｎＲＴ—ＰＣＲ法，对美洲毒株和欧洲毒株混合感染的一群猪进行鉴别诊断。Ｗｅｓｌｅｙ等对ＯＲＦ５的ＲＴ—ＰＣＲ产物进行ＲＦＬＰ分析时可以区分疫苗株和野毒株。为了能够早期检测病毒的感染量，ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＨｅｎｎｉｎｇｓＪ等根据ＰＲＲＳＶＯＲＦＩｂ和ＯＲＦ７的序列设计引物并建立了套式ＰＣＲ，灵敏度达ｌＯ个感染性病毒粒子／ｍＬ，优于病毒分离。Ｋｏｎｏｖｔ４７】等用巢式．ＰＣＲ检测方法，结果显示该法敏感性比常规ＰＣＲ高１００倍，临床样品检出率高于病毒分离，故非常适用于ＰＲＲＳＶ的诊断、分离及病毒性持续感染研究。７仇华吉等１９９８年根据美洲型ＰＲＲＳＶＩＡＦｅｘｐ９１株基因组ＯＲＦ７序列设计了一对引物，用ＲＴ－ＰＣＲ证实了国内早期ＰＲＲＳＶ分离株ＣＨ—ｌａ的基因型为美洲型。宋志军等【４８Ｊ建立了ＰＲＲＳＶＴａｑＭａｎ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，其灵敏度可达５．０ｘｌｏｏ挎贝／“Ｌ，比常规ＲＴ．ＰＣＲ灵敏度高１００倍。４．３．２原位杂交Ｓｕｒ等１４９】通过Ｉ汀一ＰＣＲ扩增ＯＲＦ７的４３３ｂｐ片段．应用地高辛标记方法制备ＰＲＲＳＶ特异性ｃＤＮＡ探针，建立了检测ＰＲＲＳＶＲＮＡ的原位杂交技术。该方法可以在肺、淋巴结等组织的感染细胞内检测病毒的核酸。Ｃｈｅｏｎ等也用此法制备了ＰＲＲＳＶ非放射性ｃＤＮＡ地高辛探针，进行原位杂交也获得了类似的结果。Ｃｈｕｃｈ等【则将原位ＲＮＡ／ＲＮＡ杂合体与抗地高辛抗体碱性磷酸酶结合，制备出地高辛ＲＮＡ探针，建立了敏感荧光原位杂交技术。任慧英等【５１１以猪繁殖与呼吸综合征病毒ＡＴＣＣＶＲ一２３３２株基因组为模板，制备出地高辛标记的ｅＤＮＡ探针，成功用于组织原位杂交检测。核酸探针杂交技术由于引物和探针可大量合成，长期保存，检测速度快，结果可靠，同时还可避免散毒。是一种快速、准确、灵敏的好方法。５．ＰＲＲＳＶ疫苗研究进展猪繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）自出现以来，给世界各国的养猪业带来巨大的危害，至今仍然是造成养猪业经济损失的重要疾病之一。在目前条件下，采用免疫接种仍是防制该病的有效措施，目前常用的商品化常规疫苗主要有两类：灭活苗和弱毒苗。５．１灭活苗西班牙、荷兰、加拿大、美国和中国等都已研制出ＰＲＲＳ灭活疫苗并商品化。主要用于预防后备母猪和经产母猪感染ＰＲＲＳ所造成的繁殖障碍。１９９３年西班牙研制的Ｃｙｂｌｕｅ灭活疫苗，可提高母猪的繁殖力，改善死胎状况，提高断奶仔猪头数及母猪年窝产仔数。郭宝清等【５２】将国内分离的ＰＲＲＳＶＣＨ—ｌａ毒株研制成ＰＲＲＳ油乳剂灭活疫苗。该疫苗免疫猪后２０ｄ左右抗体就达到高峰，并可持续６个月左右，具有较长的免疫保持期。赵坤等ｔ５３】利用蜂胶作为佐剂研制出ＰＲＲＳ蜂胶佐剂灭活疫苗，将其接种于受ＰＲＲＳＶ严重威胁的猪群，保护率达９８％以上。但占松鹤等【５４】报道国内三个厂家生产的ＰＲＲＳ＇灭活疫苗在生产实践中的免疫效果观察表明抗体维持时间不长、疫苗效果不理想。灭活疫苗的优点是安全性好，灭活苗主要用于预防后备母猪和经产母猪感染ＰＲＲＳＶ所造成的繁殖障碍。灭活疫苗的缺点是免疫剂量大、免疫次数多和免疫产生期较长，因而不适合仔猪免疫。仔猪和架子猪带毒是猪场ＰＲＲＳＶ持续存在的最重要原因，因此，仅使用灭活疫苗难以控制和根除ＰＲＲＳＶ在猪场的存在和流行。５．２弱毒疫苗目前，西班牙、荷兰、美国已研制出商品化ＰＲＲＳ弱毒疫苗。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒｌｎｇｌｅｈｅｉｔｍ公司于１９９５年首次推出商品化减毒疫苗ＲｅｓｐＰＲＲＳ／Ｒｅｐｒｏｔｍ，用于３＂－－１８周龄猪的预防。我国何信群等【５５】制备了ＰＲＲＳＶ减毒活疫苗，免疫结果结果表明，第１４ｄ即可检测出ＰＲＲＳＶ中和抗体。２０ｄ～３５ｄ左右出现抗体高峰，并可持续３个月以上，有较长的免疫保护期。杜兰荣等对ＰＲＲＳＶ免疫猪场血清学检测结果表明：弱毒疫苗免疫猪场猪群抗体阳性率达到９０．６５％，灭活苗免疫仅为７５．４９＊，６。ＰＲＲＳ弱毒疫苗具有免疫效果好、免疫力坚强、免疫期长等优点。弱毒疫苗主要用于仔猪接种，弱毒疫苗的体液免疫效果要优于灭活疫苗。但是，弱毒苗的安全性不可靠，存在毒力返强造成苗毒的传播。且用血清学检测方法不能分区疫苗免疫猪和自然感染猪。丹麦Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ等试验证明，用ＰＲＲＳ弱毒苗接种母猪后，会对母猪的繁殖性能造成不利影响，甚至可通过子宫感染胎猪。引起ＰＲＲＳ的持续感染和毒血症的发生。５．３基因工程疫苗５．３．１亚单位疫苗近年来，在ＰＲＲＳＶ分子生物学方面的研究表明，ＰＲＲＳＶ的ＧＰ５和ＧＰ３蛋白均是主要保护性抗原，利用杆状病毒表达的ＧＰ５和ＧＰ３蛋白制成亚单位疫苗在动物体内可诱导较好的保护性免疫。Ｐｌａｎａｔ５６ｌ用杆状病毒表达的ＧＰ３免疫猪，甚至可产生比ＧＰ５蛋白免疫具有更好的保护作用，并发现通过重组的ＧＰ３～ＧＰ５蛋白共同免疫可产生更好的免疫效果。Ｂｏｒｏｕｓｈｏｎ用大肠杆菌表达的ＧＳＴ－ＧＰ５融合蛋白免疫猪后，不仅能检测出针对ＧＰ５的中和性抗体而且可产生针对ＧＰ５的特异细胞免疫。另外，还可有效地阻止肺泡巨噬细胞的损伤，因此，ＧＰ３～ＧＰ５有望成为亚单位疫苗的候选者。５．３．２ＤＮＡ疫苗Ｐｉｒｚａｄｅｈ等人制备了针对ＰＲＲＳＶＧＰ５蛋白的ＤＮＡ疫苗，经小鼠和猪体免疫试验都可检测到中和抗体的产生，而且猪的ＰＢＭＣ（外周血单核细胞）在大肠杆菌表达的ＧＰ５的刺激下出现了淋巴细胞增殖，说明ＤＮＡ疫苗诱导产生了病毒特异性的体液免疫和细胞免疫。江云波等【５。７】构建了共同表达ＰＲＲＳＶＧＰ５和Ｍ蛋白所形成的异二聚体（ＰＣＩ—ＯＲＦ５／ＯＲＦ６）的新一代ＤＮＡ疫苗，用来研究预防ＰＲＲＳＶ，该疫苗可以提高ＤＮＡ疫苗的潜力。５．３．３病毒活载体疫苗国外Ｇａｇｎｏｎ等用复制缺陷型的人５型腺病毒载体表达ＧＰ５基因免疫猪，结果可诱导特异性的免疫。Ｂａｓｔｏｓ等人【５８】构建了表达ＰＲＲＳＶＧＰ５和Ｍ蛋白的重组牛结核分枝杆菌ＢＣＧ，免疫小鼠后均检测到了特异性抗体，试验结果表明ＢＣＧ可表达ＰＲＲＳＶ的抗原，并能刺激小鼠产生抗病毒蛋白的免疫反应。国内仇华吉等以ＰＲＶＢａｒｔｈａ－Ｋ６１株为载体，构建表达ＰＲＲＳＶ主要免疫原性蛋白ＧＰ５的重组伪狂犬病病毒为疫苗，免疫仔猪后可以对ＰＲＲＳ强毒攻击产生有效保护。智海东掣５９】从含有ＰＲＲＳＶ核衣壳蛋白（Ｎ）的质粒扩增出９Ｎ基因，构建禽痘病毒转移载体。间接免疫荧光试验证明了ＰＲＲＳＶＮ蛋白在重组病毒感染的ＣＥＦ细胞中获得表达，该研究为研制ＰＲＲＳＶ非复制型载体疫苗打下了基础。６．结语与展望综上所述，ＰＲＲＳＶ给养猪业带来了严重的危害，虽然在ＰＲＲＳＶ的分子生物学研究取得了很大的进展，但是仍有许多问题尚不清楚。如不同地区各分离毒株之间为什么存在广泛的抗原差异性？ＰＲＲＳＶ基因组碱基缺失、氨基酸置换与毒力增强之间的关系？现有防制措施为何效果不佳？如何开发安全、可靠的保护性疫苗，尚有待于人们进一步研究。１０１引言１９８７年，猪繁殖与呼吸综合征在美国中西部被首次发现，１９９１年Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ等首次分离到病毒。我国郭宝清等于１９９６年首次从暴发流产猪的胎儿中分离到ＰＲＲＳＶＣｈ．１ａ株，此后国内不断有地方分离株的报道。２００６年夏季，我国南方数省暴发的“猪高热病”疫情给养猪业带来巨大损失。安徽省也未能幸免，现有的研究结果表明：该病应为多病原混合感染及继发感染引起的，其中猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株是主要病原之一，为了证实ＰＲＲＳＶ在安徽省的存在。本研究从安徽省发生“猪高热病”猪场采集发病猪肺、脾、淋巴结等组织病料，接种敏感细胞，分离到５株疑似ＰＲＲＳＶ，对其进行了一系列的鉴定；ＰＲＲＳＶ分为两种基因型，即欧洲型和美洲型。欧洲型ＰＲＲＳＶ主要流行于欧洲，而美洲型ＰＲＲＳＶ主要流行于美洲和亚太地区。已报道的中国分离的ＰＲＲＳＶ毒株均为美洲型，ＰＲＲＳＶ不同分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，Ｎｓｐ２基因和ＯＲＦ５基因是ＰＲＲＳＶ全基因组中变异最大的两个区域，对这两个基因变异的分析在一定程度上可以反映ＰＲＲＳＶ整个基因组的变异趋势。为了解我省此次猪“高热病”中ＰＲＲＳＶ的来源、基因型、毒株的变异情况，本研究将选取所分离到的毒株，对其Ｎｓｐ２高变区和ＯＲＦ５测定和序列分析；此次“猪高热病”的感染猪群以高热、呼吸困难、皮肤发红为特征，出现为高热、高发病率、高死亡率、低治愈率的“三高一低”新特点，与以前的ＰＲＲＳ病症相比有很大差异，为了掌握ＰＲＲＳＶ安徽分离株的致病性，感染猪的临床症状、大体病变、病理组织学变化，本研究将选用所分离的毒株进行了仔猪的人工感染试验。２材料与方法材料猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）和阳性血清由浙江农科院惠赠，猪繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）阳性血清由江苏农科院惠赠，ＦＩＴＣ．羊抗猪ＩｇＧ，购自北京博奥森生物技术有限公司。２．１．２菌种和质粒受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ由本实验室保存；ｐＭＤ１８一Ｔ载体为ＴａＫａＲａ产品。２．１．３细胞２．１２．１．１标准毒株和阳性血清Ｍａｒｃ．１４５、ＰＫ．１５细胞由扬州大学兽医学院实验室惠赠。２．１．４实验动物来源相同的４０日龄健康仔猪４头，采集血清经试剂盒ＰＲＲＳＶ抗原和抗体检测均为阴性。２．１．５病料２００７．０３＂＇２００８．１２采集采自安徽省合肥、六安、滁州、宿州、黄山、阜阳和池州等猪的肝、脾、肺、肾和淋巴结等６０份临床组织病料，记录并编号，一７保存备用。２．１．６主要仪器表２－１试验中使用的主要仪器Ｔａｂ．２—１Ｏ℃ＭａｉｌＩｅｑｕｉｐｍｅｎｔｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ仪净化工作台５Ｗ－－ＣＪ－ＩＦ器苏州净化设备有限公司德国ＢＩＯＭＥＴＲＡ公司美国ＳＨＥＬＬＡＢ公司德国ＢＩＯＭＥＴＲＡ公司南京江南永新光学有限公司日本ＯＬＹＭＰＵＳ公司珠海黑马医学仪器有限公司珠海黑马医学仪器有限公司北京六一仪器厂Ｐａｃｋ梯度ＰＣＲ仪０５０－－８１０Ｔｇｒａｄｉｅｎｔ９６型Ｃ０２培养箱ＰＣＲ仪ＴＩＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ型荧光显微镜倒置显微镜台式高速离心机ＴＧＫ．１６Ｈ型ＧＳＧ２０００凝胶成像分析系统水平电泳槽ＤＹＣＰ－３１Ｂ型恒压恒流电泳仪ＳｔａｎｄａｒｄＰｏｗｅｒＰ２５型德国ＢＩＯＭＥＴＲＡ公司１２电热恒温水浴锅ＤＫ．ｇＤ型漩涡混合仪ＷＨ一２型超速冷冻离心机２Ｋｉ５型超纯水器ＭＩＬＬＩ－Ｑ－－７０℃超低温冰箱ＤＫ－ｇＤ电热恒温水槽ｓＰＸ．２５０Ｂ—Ｄ振荡培养箱ＤＨＧ－９１上海精宏实验设备有限公司上海沪西分析仪器厂德国ＳＩＧＭＡ公司美国密理博中国有限公司三洋有限公司上海一恒科技有限公司上海博迅实业有限公司上海精宏实验设备有限公司北京赛多利斯仪器系统有限公司ＬＥＩＴＺ公司４０Ａ电热恒温鼓风干燥箱ＴＤ－ｉ１０２电子天平切片机１５１２型显微镜电热恒温箱ＣＨＦ－！型南京江南永新光学有限公司上海市医疗器械一厂２．１．７主要试剂ｄＮＴＰ、ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００和ＵＮＩＱ．１０柱式动物基因组ＤＮＡ抽提试剂盒购自上海生物工程有限公司，ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／肛Ｌ）、Ｍ．ＭＬＶ（２００Ｕ／｝ｔＬ）、ＲＮａＭｎ（４０ｍ为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品，性内切酶Ｈａｎｄｉｌｌ，ＢａｍＨＩ、ＤＮＡ快速回收试剂盒和ｐＭＤｌ８一Ｔ载体为ＴａＫａＲａ公司产品。ＤＭＥＭ培养基为ＧＩＢＣＯ产品，琼脂糖为西班牙Ｂｉｏｗｅｓｔ公司生产，Ｔｒｉｚｏｌ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品，胰酶为Ｓｉｇｍａ公司产品。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｎｓｐ２１５９４＂－－１６８０）ＲＴ．ＰＣＲ检测试剂盒、猪瘟ＲＴ—ＰＣＲ检测试剂盒、猪圆环病毒ＰＣＲ检测试剂盒均由北京世纪元亨动物防疫技术公司产品、猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒购自美国ＩＤＥＸＸ公司。其它化学试剂，如ＮａＨＣ０３、ＮａＯＨ、ＥＤＴＡ、无水乙醇、氯仿、异丙醇等为国产分析纯产品。２．１．８溶液和培养基的配制２．１．８．１ＤＭＥＭ培养基的配制：ＤＭＥＭ粉一袋（１３．４ｇ）溶于１０００ｍＬ双蒸水中，２．２加ＮａＨＣ０３备用。２．１．８．２ｇ，搅拌充分溶解后调ｐＨ值至７．２，０．２２ｌｕｎ滤过除菌，４℃保存０．２％胰酶溶液的配制：称取胰蛋白酶０．２ｇ，溶解于１００ｍＬ双蒸水中，０．２２岬滤菌器过滤除菌，－－２０℃保存备用。２．１．８．３０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ的配制：１８．６１ｇＥＤＴＡ·１２Ｈ２０溶于８０ｍＬ双蒸水中，用ＮａＯＨ调ｐＨ至８．０，定容到１００ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，室温保存备用。２．１．８．４阿氏液的配制：葡萄糖２．０５克，柠檬酸钠０．８克，柠檬酸Ｏ．０５５克，氯化钠０．４２克，加蒸馏水至１００毫升，加热溶解后将ｐＨ值调到６．１，１５分钟的高压灭菌，４。Ｃ保存备用。２．１．８．９５０ｘＴＡＥ电泳缓冲液的配制：＂Ｉｒｉｓ２４．２ｇ，冰乙酸５．７ｌｇ，Ｏ．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ１３（ｐＨ８．Ｏ）１０ｍＬ。磁力搅拌器溶解后，定容至１００ｍＬ，常温保存备用。２．１．８．１０１．２％琼脂糖凝胶的配制：称取０．１２ｇ琼脂糖溶于１００ＩｌＬ１０ｍｇ／ｍＬｍＬｌ×ＴＡＥ电泳缓冲液中，溶化后加入５．００．５ｍｇ／ｍＬ。２．１．８．１ｌＮａＣＩ１０．０ＥＢ贮存液，使凝胶中ＥＢ终浓度达到高盐ＬＢ培养基的配制（１Ｌ）：胰化蛋白胨１０．０ｇ，酵母提取物５．０ｇ，ｇ，双蒸水１Ｌ，摇匀后用ｌｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调节ｐＨ至７．２，１２１℃高压蒸汽灭菌３０ｍｉｎ后室温放置备用。２．１．８．１２固体高盐ＬＢ培养基（氨苄）的制备（ＩＬ）：Ｔｒｙｐｔｏｎｅ５．０ｇ，ＮａＣＩ１０．０１０．０ｇ，ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔｇ，琼脂粉１２．０ｇ双蒸水ｌＬ，摇匀后用１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调节ｐＨ至７．２，１２１℃高压蒸汽灭菌３０ｍｉｎ，室温放置，待温度降至４０℃，加入２ｍＬ５０ｍｇ／ｍＬ的氨苄青霉素，无菌操作，倒入平皿，４℃储存备用。２．１．９引物设计根据Ｇｅｎ．Ｂａｎｋ中ＰＲＲＳＶ标准株ＡＴＣＣ．ＶＲ２３３２和ＨｕＮ４（Ｎｏ．ＥＦ５ｌ７９６２）的基因序列，按照相关文献【８】设计的扩增ＰＲＲＳＶ的Ｎｓｐ２部分基因和ＯＲＦ５全基因的引物，预期分别扩增７９６ｂｐ和６４８ｂｐ左右的片段。引物由上海生物工程有限公司。表２－２引物序列Ｔａｂ．２－２ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｆｏｒＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ２．２方法２．２．１细胞培养生长液为含有８％胎牛血清（ＦＢＳ）、青霉素１００Ｕ／ｍＬ、链霉素１００１上ｇ／ｍＬ的ＤＭＥＭ培养液；维持液为含２％ＦＢＳ、青霉素１００１３／ｍＬ、链霉素１００１．ｔｇ／ｍＬ的ＤＭＥＭ培养液。Ｍａｒｃ．１４５置于５％的Ｃ０２培养箱中３７℃培养至单层后传代培养。２．２．２病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用不含血清的ＤＭＥＭ液研磨制成５倍～１０倍的乳悬液，反复冻融３次后，经１００００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，上清悬液用０．２２ｐｍ微孔滤膜过滤除菌，－－７０℃保存备用。２．２．３病毒的分离取ｌｍＬ上述处理的病料上清液接种长成单层的Ｍａｒｃ一１４５细胞，３７℃吸附１４ｌｈ后倒弃接种液，补加维持液３．５ｍＬ，继续培养３ｄ～５ｄ，将培养物反复冻融３次，冻融液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液ｌｍＬ盲传。待出现典型细胞病变（ＣＰＥ）时收获病毒培养物。在液氮中保存待用；连传８代未出现ＣＰＥ且ＰＣＲ检测为阴性者判为阴性。２．２．４病毒的形态学观察将分离病毒的第１５代细胞培养物冻融３次，经４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ收获上清，再经３５０００ｒ／ｍｉｎ超速离心２ｈ浓缩病毒，用ＰＢＳ浮悬病毒，吸取少量悬液加２％的磷钨酸负染１分钟，经透射电镜观察病毒形态。２．２．５间接免疫荧光试验将Ｍａｒｃ－１４５细胞接种２５ｍＬ细胞培养瓶中，待细胞长成单层后，接种所分离病毒７２ｈ后弃掉培养液，用含有０．０１％胰酶的ＥＤＴＡ消化后，用ＰＢＳ离心洗涤，然后在载玻片上涂片，干燥后用４。Ｃ冷丙酮固定２０ｍｉｎ，滴加美洲型标准株ＰＲＲＳＶＶＲ．２３３２阳性血清，置湿盒３７℃作用１ｈ，经ＰＢＳ洗涤后再滴加ｌ：１００稀释的ＦＩＴＣ一羊抗猪ＩｇＧ置湿盒于３７℃作用１ｈ，经ＰＢＳ洗涤３次，晾干后用甘油ＰＢＳ封片，置荧光显微镜观察结果。同时设阴性血清、正常细胞作为对照。２．２．６血凝试验将细胞分离的病毒液与１％鸡、兔红细胞按规程方法进行微量血凝试验，并用新城疫病毒作阳性对照。２．２．７ＲＴ－ＰＣＲ鉴定按猪繁殖与呼吸综合征试剂盒试剂盒说明提取分离病毒细胞培养物的总ＲＮＡ，反转录反应条件为：４２℃ｌｈ，９８℃５ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ；ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ；５５℃３０℃１０ｍｉｎ。取７ｐＬＳ，５５。Ｃ３０Ｓ，７２℃３０Ｓ，共进行３５个循环；最后７２ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时用猪瘟病毒、猪圆环病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒检测分离病毒的细胞培养物，按试剂盒说明书方法进行。２．２．８病毒总ＲＮＡ的提取将采集的ＰＲＲＳＶ阳性发病猪的肺脏、脾脏、淋巴结等组织剪碎混匀后，取１ｇ左右进行研磨，加入灭菌生理盐水配成ｌ：５的悬液，细胞毒直接将病毒细胞培养物的收获液反复冻融三次后，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，所得上清液分装于灭菌离心管中，一２０℃保存备用。取处理好的病料毒和细胞毒的上清液１００１ｘＬ，加入６００ｕｌ的ＴＲＩＺＯＬ，反复颠倒几次混匀后，室温下放置５ｍｉｎ。加入１５０９Ｌ氯仿，旋涡振荡１５ｓ混匀，室温下放置２＿．３ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。取上清转移到新的ＥＰ管，再加入等体积１５异丙醇混匀，室温下放置１０ｍｉｎ。１２００００００ｒ／ｍｉｎ离一ｔ二，１０ｍｉｎ，弃去上清，再加入７５％的酒精１０００ｕｌ，洗涤沉淀，１２ｒ／ｍｉｎ离心５—１０ｍｉｎ。弃去上清，晾干ＥＰ管中的ＲＮＡ后，用无ＲＮａｓｅ的水２５ｕＬ溶解，一２０℃保存备用或即用。２．２．９２．２．９．１Ｎｓｐ２部分序列和ＯＲＦ５的扩增与测定ｌ玎反转录的总体积为５０．０“Ｌ，在灭菌１．５ｍＬ离心管中加入：下游引物总ＲＮＡ１．０ｐ．Ｌ９．０“Ｌ混匀后７０℃１０ｍｉｎ，冰水浴５ｍｉｎ，再依次加入下列试剂：１０ｘｂｕｆｆｅｒ２．０肛Ｌ１．０ｇＬ１．０ｌｘＬ１．０ｇＬ１０．０ｇＬ２５．０１ａＬ５１０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘＲＮａｓｉｎＭ－ＭＬＶＤＥＰＣＨ２０总体积上述溶液混匀后再置于４２＂（２水浴锅中保温反应ｌｈ，然后９４＂Ｃｍｉｎ，冰水浴５ｍｉｎ，即为ｅＤＮＡ第一链，可用来进行ＰＣＲ反应或保存于一２０℃备用。２．２．９．２ＰＣＲ反应体系１０×Ｂｕｆｆｅｒ缓冲液５９ＬｄＮＴＰ（２５ｍＭｅａｃｈ）ｌｇＬＰｌ上游引物ｌ“ＬＰ２下游引物１１．ｔＬＭｇＣ１２（２０ｍｇ／ｍＬ）Ｔａｑ聚合酶（ＳＵ／Ｉ．ｔＬ）ｅＤＮＡｄｄＨ２０３９Ｌ０．５１ｕＬ５“Ｌ３３．５１ｘＬ５０．０９Ｌ总体积２．２．９．３ＰＣＲ扩增条件９５℃９４℃５６℃７２℃７２℃５ｍｉＩｌ５０Ｓ５０ｓ５０ｓ）３５刚ｅｓ１６１０ｍｉｎ２．２．９．４ＲＴ－ＰＣＲ产物的鉴定ｇＬ反应结束后取５ＰＣＲ产物用１．２％琼脂糖凝胶电脉，凝胶中含０．５弘∥ｍＬ溴化乙锭，电泳缓冲液为１ｘＴＡＥ，电泳完毕后于紫外凝胶成像系统观察拍照。２．２．９．５ＰＣＲ产物的回收ＲＴ－ＰＣＲ产物在０．８％的琼脂糖凝胶上电泳后，切下目的条带，用ＴａＫａＲａ生物技术有限公司的凝胶回收试剂盒回收ＲＴ－ＰＣＲ产物。具体按说明书操作如下：（１）加入３倍凝胶体积加入Ａ溶液６５℃保温１０ｍｉｎ，其间轻摇离心管几次，使胶完全溶化（约２０ｍｉｎ）。；（２）在管中加入１／２体积溶液Ａ的溶液Ｂ，混匀后将溶液移于离心柱中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心ｌｍｉｎ，弃滤液：（３）将５００ｌｘＬＲｅｓｉｎＡ加入离心柱中，１２０００ｒ／ｍｉＩｌ离心３０Ｓ，弃滤液；（４）将７００ｇＬＲｅｓｉｎＢ加入离心柱中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，弃滤液；ｍｉｎ；（５）重复步骤（４），然后１００００ｒ／ｍｉｎ再离心ｌ（６）将离心柱置于新的１．５ｍＬ的离心管上，在离心柱膜的加入３０ｐＬ灭菌双蒸水（６５℃预热），室温静置ｌｍｉｎ；（７）１００００ｒ／ｍｉｎ离心ｌｍｉｎ洗脱ＤＮＡ；（８）取２ｐＬ在１．０％的琼脂凝胶中电泳后紫外灯下观察回收结果。剩余保存于．２０℃备用。２．２．９．６ＰＣＲ产物与ｐＭＤｌ８一ＴＶｅｃｔｏｒ连接按ＴＡＫＡＲＡ公司Ｔ载体连接试剂盒说明进行：ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ４．０ＩｌＬ１．０ｐＬ５．０１．ｔＬ１０．０“ＬｐＭＤ１８一Ｔｖｅｃｔｏｒ（５０ｐ∥肛Ｌ）ＰＣＲ纯化产物Ｔｏｔａｌ１６℃连接３０ｍｉｎ。２．２．９．７感受态细胞的制备（ＣａＣｌ２法）（１）从３７℃培养过夜的新鲜培养基中挑取ＤＨ５ａ单菌落，接种于３ｍＬ不含抗生素的ＬＢ培养液中，振荡培养过夜（１２ｈ）；（２）．取２０ｐＬ培养过夜物接种于４ｍＬＬＢ培养基中剧烈振荡培养３ｈ，至ＯＤ６００为０．２一－０．４；（３）无菌条件下转移细菌培养物至一个无菌的１．５ｍＬ离心管中，冰浴１０（４）４℃下１２１０００００ｍｉｎ；ｒ／ｒａｉｎ离心２ｍｉｎ，弃上清，倒置离心管沥干液体，加入６００“Ｌｒａｉｎ；ｍｍｏｌ／Ｌ冰冷的ＣａＣｌ２溶液，悬浮菌体沉淀，冰浴１００００（５）４℃下１２ｒ／ｍｉｎ离心１０ｒａｉｎ，弃上清，１００９Ｌ１００ｍｍｏｌ／Ｌ冰冷的ＣａＣｌ２重新悬浮菌体，然后分装于冰冷、无菌的离心管中（１００斗Ｌ／管），可以立即使用，也可以放入４℃冰箱２４ｈ内使用。２．２．９．８连接产物的转化１７（１）新鲜制备的或在－－７０℃下保存的１００ｌｘＬ感受态细胞置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮：（２）加入５ｐＬ连接液，轻轻混匀；（３）冰上放置３０ｍｉｎ；（４）４２℃水浴热激９０（５）冰上放置２ｍｉｎ；ｓ；（６）加入９００９ＬＬＢ培养基，３７℃下１００ｒ／ｒａｉｎ－－－１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养ｌ（７）室温下４液将细胞悬浮；（８）将细菌涂布在含氨苄青霉素（１００ｇｇ／ｍＬ）固体培养基平板中；０００ｈ；ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，用头吸掉８００ｇＬ上清液，用剩余的培养（９）平板在３７℃下正向放置２ｈ以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜（１２ｈ～１６ｈ）。挑白色菌落培养后提取质粒。２．２．９．９重组质粒的提取按ＴａＫａＲａ生物技术有限公司微量质粒提取试剂盒说明书进行：（１）无菌从ＬＢ平板中挑取白色单菌落，接种于５ｍＬ含有氨苄青霉素（１００ｇｇ／ｍＬ）的ＬＢ培养液中，３７℃振荡培养１２ｈ～１６ｈ：（２）取１．５ｍＬ培养过夜菌液放入离心管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃上清；（３）用２５０ｇＬ的ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ（含ＲＮａｓｅＡＩ），充分振荡悬浮细菌沉淀；（４）加入２５０ｌｘＬ的ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ，轻轻地上下翻转混合５～６次，使菌体充解，形成透明溶液；（５）加入４００此的４℃预冷的ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ，轻轻地上下翻转混合５～６次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置２ｍｉｎ；（６）室温１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清；（７）将上清置于离心柱中，３０００ｒ／ｍｉｎ离心ｌｍｉｎ，弃滤液；（８）将５００Ｉ＿ｔＬＲｅｓｉｎＡ加入离心柱中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，弃滤液；（９）将７００ｇＬＲｅｓｉｎＢ加入离心柱中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心ｌｍｉｎ，弃滤液；（１０）重复步骤９．，然后１２０００ｒ／ｍｉｎ再离心ｌｍｉｎ：（１１）将离心柱置于新的１．５ｍＬ的离心管上，在离心柱膜的加入８０ｐＬ水，（６５℃预热），室温静置ｌｍｉｎ：（１２）１２０００。／ｍｉｎ离心ｌｍｉｎ洗脱ＤＮＡ，１．０％的琼脂糖凝胶中电泳观察结果。２．２．９．１０重组质粒的鉴定用特定的酶对每个重组质粒进行双酶切鉴定。ＢａｍＨｌＨｉｎｄｌｌＩ１０ｘＴａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ１．５ｐＬ１．５９Ｌ６．０９Ｌ１８质粒ＤｄＨ２０１５．０１．ｔＬ６．０ｐＬ３０９Ｌ总体积反应条件：３７℃４ｈ，１．Ｏ％的琼脂糖凝胶中电泳观察结果。２．２．９．１ｌ重组质粒的测序分析将ＰＣＲ扩增鉴定和酶切鉴定均为阳性的单克隆，取２００ｌｘＬ菌液由上海生工公司测序。对测序结果用ＤＮＡＳｔａｒ５．０软件进行比较，确定各ＰＲＲＳＶ分离株与已发表的国内外ＰＲＲＳＶ分离株Ｎｓｐ２高变区和ＯＲＦ５核苷酸的同源性。同时绘制它们的系统进化树。所采用的ＰＲＲＳＶ各毒株有关信息（见表３、表４）表２－３ｔｌｂ．２．３５株分离株的信息表ｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓＧｅｎｅｒａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ５ＰＲＲＳＶ表２．４作为比对序列的基本信息Ｔａｂ．２－４ＧｅｎｅｒａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｏｆＰＩｔＲＳＶｓｔｒａｉｎｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ２．２．１０病毒的增殖将的ＰＲＲＳＶＳＣＨ０７的第ｌ５代病毒接种于生长４８ｈ形成单层的Ｍａｒｃ－１４５细胞，接种后吸附吸附ｌｈ，加维持液。每日观察细胞，在有８０％－－－９０％的细胞出现病变时收获病毒１９２．２．１１病毒的半数细胞感染量测定（ＴＣＩＤｓｏ）将分离病毒ＳＣＨ０７作１０。１＂－－＇１０－８系列稀释，分别接种于单层的Ｍａｒｃ．１４５细胞９６孔培养板，每个稀释度接８孔，每孔０．１ｍＬ，３７℃作用１ｈ。每孔再加入０．１ｍＬ维持液，同时设不接病毒的正常细胞对照，置于５％的Ｃ０２培养箱中３７℃培养，连续观察记录细胞病变７ｄ，结果按Ｒｅｅｄ—Ｍｕｅｎｃｈ法计算【３】。２．２．１２攻毒试验随机将试验猪分成实验组、阴性对照两组，每组各２头，实验组仔猪经口、鼻接种ＰＲＲＳＶＳＣＨ０７株病毒细胞培养物，每头５ｍＬ；阴性对照组接种正常细胞培养物，每头５ｍＬ，两组隔离饲养。接种后连续观察仔猪的临床表现、测定体温，记录发病和死亡情况，分别在第３、７、ｌＯ、２０、３０、４０ｄ各采血一次。供检测抗原和抗体。２．２．１３血清中ＰＲＲＳＶ抗体的检测用猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒测定试验猪血清中ＰＲＲＳＶ抗体，按试剂盒说明书方法进行。Ｓ／Ｐ＞０．４为阳性，２．２．１４病料中ＰＲＲＳＶ的检测采集实验猪的肺、脾、肾、淋巴结等组织样品经混样处理，用猪繁殖与呼吸综合征ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒检测ＰＲＲＳＶ，按试剂盒说明书方法进行。２．２．１５石蜡切片的制作Ｓ／Ｐ＜０．４为阴性。采集心、肺、脾、肝、肾、淋巴结等组织样品用１０％固定、石蜡包埋、切片、ＨＥ染色、光学显微镜下观察。２．２．１６鉴别诊断无菌操作挑取攻毒组死亡猪的脾、肝组织，在兔血琼脂平板上划线进行细菌分离，经３７℃培养２４ｈ后观察结果。采集攻毒组猪的脾、肺、淋巴结等组织进行猪瘟病毒、猪圆环病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒检测ＰＲＲＳＶ抗原，按试剂盒说明书方法进行。３结果■————————３．３间接荧光试验用ＰＲＲＳＶＶＲ－２３３２抗体阳性血清进行间接荧光抗体染色。检测结果发现感染细胞的胞浆内出现黄绿色特异性荧光（图３—３），而对照组的Ｍａｒｃ－１４５细胞均未见到荧光。ＡＭａｒｃ－１４５ｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｌＳＯｌａｔｅＢＮｏｄａｌＭａｆｏ－１４５幽３－３问接免痤荧光试验结粜目Ｆｉ９３－３Ｒｅ驯ｌｔｓｏｆＩＦＡｏｎＭａＢｌ４５ｉｎｆｅｃｔｅｄＭｍｉｓｏｌａｔｅｓｔｒａｔａ３．４血凝试验结果分离株不能凝集鸡、兔红细胞，对照组ＮＤＶ能凝集鸡、兔红细胞。说明分离株没有血凝忡，符合ＰＲＲＳＶ无血凝件的特征３５ＲＢＰＣＲ鉴定结果对发病猪的组织病料、分离株细胞培养物、攻毒发病仔猪组织病料进行ＰＲＲＳＶ的ＲＴ－ＰＣＲ检测，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均可扩增出约４００ｂｐ人小的条带，与阳性对照拥符ｆ罔４１：阴性对照未见条带。并且猪瘟病毒、猪圆环病毒的检测结果也为阴性。凹３４Ｆｉｇ３４ＰＲＲＳＶＲＴ－ＰＣＲ检测结果ＲｅｓｕｍｅＲＴ－ＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃＵｏｎｏｆＰＲＲＳＶ２３４５为病雌细舰培养物ＲＴ－ＰＣＲＰ物，６Ｂ１性对照７阿性对＆．ＭＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００２．３４５Ｓｕｐｃｒｎａｔ扑ｔｏｆｉｎｆ∞ｆｅｄｅｕｌｔｕｒｃ，６Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ，７ＮｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌＭＤＮＡＭａｒｋｃｒＤＬ２０００３．６分离株Ｎｓｐ２高变ｒ爻；ｆｎＯＲＦ５的ＲＴ—ＰＣＲ扩增结果用所设计的刘ＰＲＲＳＶ的Ｎｓｐ２｝；ｔ１分基因组和ＯＲＦ５全基因纽的特异性引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，经条件优化，成功地扩增出特异性的目的片段，且与预期片段大小相符，“ｓｐ２约为７９６ｂｐ，ＯＲＦ５ｆＯ为６４８ｂｐ。扩增产物经１％琼脂赭凝胶电泳结果（图３—５，图３—６１。１２１２ｂＤ２０００１０００７５０５００２５０１００２００００００７５０．５００２５０１００６４８ｂｐ１为ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＩ．２０００Ｅ的ＰＣＲ产物１ＯＮＡＮ≈０２为分离椿Ｎｓｐ２高变１为ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＩ．２０００Ｐ物２为分离株ＯＲＦ５的ＰＣＲＭａｒｋｅｒＤＬ２０００２ＴｈｅＰＣＲ瞄ｕｌｔｓｏｆ１０ｈｎＭａ＾盯ＤＬ２０００２ＴｈｅＰＣＲ—ｌ“ｏｆｈｙｐｃｒｖａｄａｂｌ２滞。∞ｏｆＰＲＲＳＶｉｓｏｌａｔｅｓｔｒａｉｎ目３ｊ分离株Ｎ神高蹙Ⅸ的ＰＣＲ产物电潍冈Ｆｉｇ３－５ＴｈｅＯＲＦ５０ｆＰＲＲＳＶＩｓｏＩａｔｅｓｔｒａｍ图３｛分离株ＯＲＦ５ＰＣＲ产自电泳目Ｆｉｇ３－６ＰＣＲ瞄ｕｋｏｆＮ∞２ｈｙｐｃｒｖａｒｌａｂｌｅＴｈｅＰＣＲ嗌ｕ］ｔｓｏｆＯＲＦ５ｏｆＰＲＲｓＶｉｓｏｌａｔｅｓｌＴａｌｎｒｅｇｉｏｎｏｆＰＲＲＳＶｉｓｏｌａｔｅ…ｎ３７重组质粒的连接将Ｎｓｐ２部分基因组和ＯＲＦ５全基因组的扩增片段的ＰＣＲ产物插入ｐＭｍ８一Ｔ载体中，构建熏组克隆质粒。提取重组克隆质粒直接进行电泳分析，重组质粒的分子量人小均比ｐＭＤｌ８－Ｔ质粒稍大（圈３—７，罔３—８），ｂｐＭ１２３４５６Ⅻ糯魏ｍ目３４重组质粒ｐＭＯｌ８ＴＮｓｐ２∞自津鉴定结果Ｆｉｇ．３—７图３－８重ｍ质粒州Ｄ１８肿ＲＦ５∞屯泳鉴定结果Ｆｉｇ３—８Ｔｈｅｉｄｃｎｔｉｆｉ∞ｔｌｏｎ皑ｕｎｏｆｔｈｃＲｃ０ＩｎｂｉｎａｍＴｈｅ＿ｄ州１６自ｔｉ∞ｒ§ｕ】ｔｐＭＤＩ８－ｎＯＲＦ５ｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐＭＤＩｇ－Ｔ－Ｎｓｐ２时ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ瞄ｉｓＩ、２、３、４、５ｔｈｅｐＭＤｌ８－Ｔｈｒ—ｂｌｎａｎｔｐＭＤｌ８１ｚＮｓ以．６ｌ、２、３、４、５ｔｈｅ唧ｏｍｂ唰ⅡＭＤ】８－Ｔ－ＯＲＦ５，６ｅｌｅｃＵ＇ｏｐｈ—ｉｓＤＭＤｌ８－Ｔ３．８重组质粒的鉴定刘每个重组质粒进行酶切鉴定，结粜说明重组克隆质粒构建成功（阿３－９、阁３－１０）。ｂｐ２Ⅻ１０００础匿３－９Ｆｉｇ３－９Ｎｓ啦的酶切鲒粜囝豳３．１０Ｆｉｇ３－１０ＯＲＦ５的静切绍来田ｌｄ％“ｎ。ｌＩｏｎｏｆｔｈｃ～ｍｂｉｎａｎｔｌｄ∞Ｉｉ６∞ＩＩｏｎｏｆｍｃｒｃ∞ｍｂ…Ｉｐｉ∞ｍｉｄｂｖｄｉｇ“ｌｃｄｂｙＢａｍＨｌ＋ＨｉｎｄＪｌｌｐｌＭｍｉｄｄｉｇｈｔｅｄｂｙＢａｍＨＩ＋Ｈｉｎｄｌ］［３．９序列分析结果３．９ｌＮｓｐ２基因序列分析ＮＳＰ２高变区扩增序列７９６个核昔酸，编码２６５个氢基酸。５个分离株ＮＳＰ２基因序列己登录ＧｅｎＢａｎｋ，ｒ程录号为ＦＪ７１６６９２一－ＦＪ７１６６９６）。对５林分离株的Ｎｓｐ２基因部分序列的相互之间段其与国内外已发表的其他毒株的Ｎｓｐ２丛凼序列进行核甘酸同游忡分析，木研究所分离毒株之｜１ＩＪ的核什酸同源性在９７９８１％～７％之问，部４：第１４４２一一１４４４位存在３个核苷酸和１５９４～１６８０位存在８７个核苷酸的缺失（图３—１１）。‘，ＪＸＡＩ等２００６年“猪商热病”后分离的毒株的核苷酸同源性在９６７％～９８．５％之ｌＩＩ】。明显高于２００６年以前的国内分离株和美洲型标准毒株ＶＲ一２３３２（表３．１）。ｓ日ｎ１１０ｎｒｅ｝ＪａｍＥ｛■ＺＰｎｓ１４１：Ｊ…，ｑ■—口—ａ口％％—Ｆ率ｏｐｍ＾钉蝎ｃｃ虻玎ｍｕ丑ｃｃｃ矗∞ｏｃ＾啦ｊｌ＆…，ｃｑＨｎａ—ｕ口∞％∞ｕｏ＃”ｐＨ∞∞ｃｇ∞∞ｎＩＧⅫｍ—￡Ｔ‘１∞凸＾脚曲饥—埠一＾ｃｒＧｒｃ∞ｔ河ｃ篦ａｘｕｍ—珊ｃｃｕｔ·ｌ＆…一２ｌＧ＾ｏ＾珏Ｔｃｃ矗址ｃ∞订ｃ—４一钾ＧＴ∞ｃＫ口Ｋ口ｘＴａ蜘ｃｃ口…：ｌ…ｘｑｌ币．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｌｌ肼∞北ｑ１４２０ｌ凶Ｃｏｎｓｅｆｌｓｕ￥－Ｉ坐坐罂塑坠晋曼兰坚芈＝｝璺盟罂塑堡号望望婴翠垒璺堡、ｌ‘∞…¨”１十ｏ『“＂ＩⅧ一ｌ…ｃｃ口—Ｔ—“｝一｝ｃｒ㈣∞ｃｃｒｒ“ｒｎＫ一∽｝…ｕｃｇ一∞Ｈ６４…｝ｏ商…ｃｃｃｃｒａ４ｎ矾ｃｃ啦ｃ＾ｃｏ北Ｉ一８一ｌ‰ｃｑｌ虮，ｅｑ『ｈ耻”ｑｌ山耻５ｑｌ自…‘ｑ二Ｉ乩吐艟…～＇４＇－－＾ｃｒ㈣ｌｌ∞ａ＾…州ｃ∞脯Ｇ埠一＾订缸ｃ删竹订ｃ㈣儡㈣拈ｃ∞ｎ—乩卜一＾胛Ⅱｃ㈣二一１；Ｉ一一ｕ％ｎ％ｎ６４一一ｍ…ｃ。ｘｒｃ“ｍＭ…Ｉ锄一ｃ懈箱—卜一＾盯町一ｃｃｃｃｒｄｎｎ盯ｃｃ—ｏ“ｌ㈣㈣＾卜一妞盯。删廿ａ＾ｎ一—ｃ翻３一ＩＩＦｉｇ，１１５个分离株Ｎ啪基目＊分序州的敏失位点ｂ＇ｔｎｅｏｆｉｓｄｍｉｏｍＤＩｓ咖１６一ｄｅｌｃｔｉ帅ｓｉｔｅｏｆｎｕｄｃｏｔｌｄｃ￥。ｑ…ｉｎＩⅦⅫＮｓＰ２％Ｏ蠡目襄里—Ｌ堑嚣㈦慝目祭詈刊等纠蒜｛嚣ｊ！Ｂ‘ｍｄ＂６嚣：｛嚣割戮｝嚣暑：ｉ黧３０ｉｌｌ引等篓置２２■１４ｊ》＿—ｉ割等《３－１Ｔａｂ．３－Ｉ攀豢辩豢百黛罐｛等ｌ等ｉｏ谶＊Ｄ７姒！！Ｈ１７９｛７９３Ｉｌｌｎ３＂８ｎ２ｉｉ“＇簇§喜嚣乏；熏鲨裂涮等∞１１¨ｎ１’ｊ３鲁溢打５个Ｈ￥《＃ｊ其他群株Ｎｓｐ２部分基目桉＊酸序列的ｌ目潭性№鞍（％）ＨｏｍｏＩ岵……即‘∞…ｒｎ∞】∞ｔｌｄｃ３ｑ“吣∞吖ｐ８ｎＩａｌＮｓｐ２ｇ龇ｅｋｈ一＿ｓ０１ａＩｌ∞ｓａｎｄｏｍ日蚰血ｓ利用ＤＮＡｓｔａｒ软件绘制５个分离株的Ｎｓｐ２的系统发育树（图１２），进化树分析结果表明：５株分离株的Ｎｓｐ２与ＨｕＢｌ、ＷｕＨＩ毒株遗传距离最近，与ＣＨ．１ａ同属一大分支，说明它们的亲缘关系较近，而与ＢＪ＿４、ＶＲ一２３３２的遗传距离较远，说明分离株的Ｎｓｐ２基困片段与２００６年以前的美洲型毒株有较大的变异。Ｕ、ＬｓｅｑＪＸＡｌ．ＳｌｅｑＨｕＮ４．ｓｅｑＧＤ．ｓｅｑＴＪ．ｓｅｑ刚．ｓａｑＨＥＢｌ．ｓｅｑＳＺＩ－ｔ０８．ｓｅｑＨＳＨ０８。ｓｅｑＤＹ０７．ｓｅｑＦＸ０８．ｓｅｑＨｕＢｌ．ｓｅｑＷｕＨｌ．ｓｅｑＳＣＨ０７。ｓｅｑＣ¨ｌａ．，ｓｅｑ＆Ｈ．Ｓ鲫Ｓ１．ｓｅｑ１２１ＶＲ－２３３２＿ｓｅｑ１——————————广—————————ｒ—————————Ｔ——————————ｒ—————————１＿—————————１１２１０８６４２ＯＮｕｅｌｅｏｔｉ匏Ｓｕｂｓ钠皤豫ｓ（ｘ＇０劭图３．１２分离毒株Ｎｓｐ２部分基因的进化树分析Ｆｉｇ．３·１２Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｂａｓｅｄｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ３．９．２ＯＲＦ５基因序列分析ＰＲＲＳＶ毒株ＯＰｔ５的基因全长为６０３ｂｐ，编码２００个氨基酸，５个分离株ＯＩ乇Ｆ５基因序列己登录ＧｅｎＢａｎｋ，（登录号为ＦＪ７１２０２９＂－－＇ＦＪ７１２０３３）。对５株分离株的ＯＲＦ５的相互之间及其与国内外已发表的其他毒株的ＯＲＦ５序列进行核苷酸同源性分析，本研究所分离毒株之间的核苷酸同源性在９６．９％～９９．７％之间。尤其与２００６年后的新分离株ＨＵＮ４株、ＨｕＢｌ株同源性最高，核苷酸同源性分别在９６．８％以上。（表３－２）Ｐｅｒｃｅｎｔ●ｄ响８暑Ｐ皇ｏ表３—２Ｔａｂ．３－２ＰＲＲＳＶ分离毒株与其他毒株ＯＲＦ５基因核苷酸序列的同源性比较（％）ＨｏｍｏｌｏｇｙｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＯＲＦ５ｇｅｎｅｂｅｔｗｅｅｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｓａｎｄｏｔｈｅｒｓｔｒａｉｎｓ利用ＤＮＡｓｔａｒ软件绘制５个分离株的ＯＲＦ５的系统发育树（图１３），进化树分析结果表明：５株分离株的ＯＲＦ５与ＨＵＢｌ毒株遗传距离最近，它们与美洲型标准株ＶＲ．２３３２同属一大分支，说明它们的亲缘关系较近，而与欧洲型标准株ＬＶ的遗传距离较远，说明所分离的５株分离株应属于美洲株。２４．４２０１５Ｎｕｄｅｏ啦ｄｅ１０５Ｏ一一～一～一～Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ＠１００）图３－１３分离霉株０１廿＇５的进化树分析Ｆｉｇ．３—１３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｂａｓｅｄＯＮＯＲＦ５ｓｅｑｕｅｎｃｅ３．１０分离病毒的ＴＣＩＤ５０测定结果按ＲｅｅｄＭｕｅｎｃｈ法计算得出ＴＣＩＤ５０结果为１０４一／０．１ｍＬ，分离病毒在Ｍａｒｃ．１４５细胞上的毒价为１０４７ＴＣＩＤ５ｄｏ．１ｍＬ。３．１ｌ临床症状接毒组的仔猪在接毒３ｄ一４ｄ后，体温升高至４ｌ℃以上，持续高热９ｄ一１５ｄ。（见表３．３）发病初期临床表现为食欲不振，精神沉郁，眼分泌物增多、有泪斑，呼吸困难、偶有呛咳，腹部皮肤发红，粪便干结，伴有间歇性腹泻，尿少而黄；后期表现为消瘦、后肢无力，喜卧，耳尖、腹下和四肢末梢皮肤发紫等症状。（图３．１４、图３．１５）接毒后１５ｄ病情严重的一头猪死亡，濒死前有肌肉震颤、四肢划水样等神经症状。另一头耐过，但生长缓慢，在高温、高湿的天气条件下病情出现反复，对照组无明显异常变化。２７§｛、娄图３－１４体温Ｈ高．精神沉郁Ｆｉｇ３－１４Ｔｈｅｓｉｃｋｐｉｇｗｉｔｈｈｉｇｈｆｅｗ∞ｄｄｃｐｒ娜ｉｏｎ㈣ｈｃｍａＩｏｕ５ｇｉＦｈＲｗ”ｇｗＲｈ‰ｈ㈣。ｕｓ３－５．５Ｔｈｅｓｉｃｋｐｉｇｂｌａｎｃｈｉｎｇｒａｓｈａｎｄ８３－１５ｐ［ｍｐｌ∞ｉｎＩ…６纂麓｛。５波：，９。篡鬟７２为试验０ｌ接群猪．３、４为ＷＭ目朱接毒耕ｉ３－３试＃＂∞＊ｍ女ｍ女Ｔａｂ３－３Ｔ哪ｐｃｍｌｕ……ｄｔｈｉｎｓｕｌａｔｅｄｐ‘∞３．１２剖检病变剖检发现仔猪肺呈暗红色，肺问质增宽明显，膈Ｊｊｌ、心叶有散在的出血点和肉样变，肺的弹性减弱；腹股沟淋巴结、肠系脱淋巴结、肺¨淋巴结肿大、｝｛｛血；脾脏肿胀、切面外翻，边缘有多边形暗红色梗死灶，背面有丘疹状突起，肾脏表面有少量针尖大出血点，心包积液。其他脏器尤明显肉眼病变：耐过猪第１５０ｄ宰杀，剖榆可见肺呈肉样变，膈叶、心叶有卅性暗｝Ｉ色实变，其他脏器无明显肉眼病变。（图３．１６、捌３－１７、图３．１８）目３－１６太叶性＂爽．肺脏心、尖叶宴变Ｆｉｇ３－１６目３－＂Ｆｉｇ３－１７ｌｏｂａｒｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ｌｕｎｇ’ｓａｎｄａｐｉｅａｌｉｓＬｙｍｐｈ∞ｏｄｉｍ㈣ｃｅ淋口＃＊＾、ｍｍａ．ｄｈｃ｜ｔｌｏｎａｇｅＩｏｂｕｓｃａｒｄｉａｃｕｓ罔３．１８脾脏肿大，出ｍＦｉｇ．３·ｊ８ｓｎＩ㈣…∞Ⅻｄｈ㈣ｏｒｃｈａｇｅ３１３病理组织检查月１１Ｊ脏肺身ｉ织发生弥漫性或局灶性纤维性肺炎，表现为细支。￡管上皮细胞肿胀、有的脱落，符腔内渗出物中有少量脱萍的上皮细胞和巨噬细胞。肺泡隔因巨噬细胞、淋巴细胞浸润及间质增生而明显增厚．舯泡壁细胞肿胀，变圆，肺泡中充斥着大量的巨噬细胞、淋巴细胞、红细胞、脱落的上皮细胞、含铁血黄素颗粒段粉红色炎性渗出物，局部肺泡ｍ现几个肺泡相互融合，形成肺气肿。（圈３－１９）小４ｔ’、、√ｊ．：．ｆ．’≯ｊｊ。’甲一．、０●．：．．７·７。’．：一、：ｉ参ｊ：÷圈３－２０淋Ｂ小结变性坏Ｍ，髓窦内％满“‰ｍ（ｘ４００Ｆｉｇ３—２０麓ＨＥ染色）ｌｉＥ）ｅｌｌｉｃｕｌｕｓｌｙｍｐｈａｆｉｃｕｓｄ《…１１…ｄ…ｓｌｓ，ＲＢＣｉｎｌｏｔｈｅｍＰ．ｄｕｌｌａｔ）ｒｓｉａｕｓ（４００ｘ脾脏：脾小体轮廓不清，淋巴细胞和网状细胞崩解、碎裂，在白髓和红髓均可见红细胞蓄彩ｌ和巨噬细胞增生，脾索肿胀、细胞变性、坏死。部分脾脏内可见脾小体中心坏死、巨噬细胞、太譬网状细胞增生和含铁血黄录颗粒沉着。（图３—２１）围３—２１睥小仲轮廓币清，■％细胞增±（ｘ４００Ｆｉｇ３—２１ａｃｉｆｆｕｓＨＥ染色）Ｈ００ｘＨＥ）Ｊｉｃａａｌｉｓ’…ｎｇｕｍ“∞ｍｎｂｌｇｕｉｔｉｎｇ，ｍａｃｒｏｐｈａｇ。ｐｒｏｌｉｆｍｔｉｎｇ肾脏：皮质出血，肾小球肿胀，肾小管肿胀，上皮细胞颗粒性变性．致使管腔狭窄：集台管尿潴留，管腔增大，肾小球周围和肾曲管之间的间质中有大量淋巴细胞和少量臣噬』ＩＩＪ胞浸润。（图３—２２）酎３－２２肾脏皮质出血、肾小管肿胀（ｘ４００Ｆｉｇ．３－２２ＫｉｄｎｅｙＣｏｒｔｉｃａｌ黼Ａｍｔｌｂｏｄｙｄｅｔｅ‰ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｅｄＨＥ肇色）ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｎｇ，ｔｕｂｕｌ％ｓｗｅｌｌｉｎｇ（４００ｘＨＥ）心脏：局部心肌纤维问有红细胞渗出、巨噬细胞和淋巴细胞浸润。（圈３－２３）圈３－２３心肌纤维间有潍Ｂ细胞攫润（ｘ４００ｒｉｇ，３·２３ＨＥ染色）ＨＥ）Ｌｙｎ讪ａｃｙｔｅｉｏｆｉｌＵｒａｔｉ∞哪。唱。ｒｍ∞ｍｕ％ｌｅｆｉｂｅｎ（４００ｘ３．１４抗体检测结果接毒组在第１０ｄ血清中首次检测到抗体，在第４０ｄ的血清中仍能检测到抗体。对照组一直为阴性。（见表３．４）表３４接毒组血清中ＰＲＲＳＶ抗体检测结果表Ｔａｂ，３－ｌａｉｌＩｌａｌｗｉｔｈｐＲＲＳＶ３．１５ＲＴ—ＰＣＲ鉴定结果对发病猪的组织病料、分离株细胞培养物、攻毒发病仔猪组织病料进行ｐＲＲＳＶ的ＲＴ－ＰＣＲ检测，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均可扩增出约４００ｂｐ大小的条带，与阳性对照相符；阴性对照未见条带。ｆ见图３－２４１图３－２４Ｆｉｇ３－２４ＭＤＮＡＲＴ－ＰＣＲｐＲＲＳＶｆｆｆｆ－ＰＣＲ捡测结果Ｒ∞ｕｋＲ＇Ｆ－ＰＣＲｆｏｒｄｅ㈣ｔｉｏｎｏｆＰＲＲＳＶＭａｒｋ目Ｄｉ２０００；Ｉ目性ＷＭ．２对照ｍ楮ｍ织悬液ＲＴ－ＰＣＲ产物：３埠＆俩猪璃料Ｊ清悬液Ｐ柳，４墒群细胞培养物ＲＴ－ＰＣＲ产物，５接毒笸病猪组织悬液ＲＴ－ＰＣＲ产物，６Ⅲ性对照３１６鉴别诊断结果术见血平扳上有任何细菌生长；猪瘟病毒、猪圆环病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测为阴件，说明试验猜没有继发感染。４．讨论与分析４．１对猪繁殖与呼吸综合征病毒安徽株的分离鉴定的讨论与分析本研究从安徽省部分猪场“猪高热病”发病仔猪的肺脏、脾脏、淋巴结等组织中分离到５株病毒，并进行了一系列鉴定。根据分离毒株致Ｍａｒｃ．１４５细胞的特征性病变、电镜观察、间接免疫荧光试验、ＲＴ－ＰＣＲ和血凝试验的结果，判定所分离的病毒为ＰＲＲＳＶ，分别命名为ＳＣＨ０７、ＤＹ０７、ＦＸ０７、ＳＺＨ０８、ＨＳＨ０８。ＰＲＲＳＶ的体外培养要求较高，在常用的ＰＫ－１５、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ细胞中不能生长。最初分离ＰＲＲＳＶ常用猪肺巨噬细胞（ＰＡＭ），ＰＡＭ对大多数不同基因型ＰＲＲＳＶ毒株都能适应，但其制备的技术难度较大。目前国内分离ＰＲＲＳＶ常使用Ｍａｒｃ．１４５细胞，本研究用Ｍａｒｃ－１４５细胞培养分离ＮＰＲＲＳＶ，病变出现的时间、代次和特征与相关报道基本一致【６０１。但与高志强等在分离的另一类美洲型变异株ＨＢ一（ｓｈ）／２００２时最初只适应在原代细胞ＰＡＭｓ上增殖，不适应Ｍａｒｃ－－１４５细胞不同，是否与ＮＳＰ２变异对细胞嗜性的改变有关，需进一步研究。ＰＲＲＳ有两种基因型，即美洲型和欧洲型。目前，在美洲、欧洲等国家相继出现了两种同时流行的新特点，美洲型不同的分离株病毒出现了明显的基因变异或缺失【６¨．检测使用的猪繁殖与呼吸综合征ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒是针对ＰＲＲＳＶ变异株设计的，说明所分离到的毒株为ＰＲＲＳＶ变异株。４．２对ＰＲＲＳＶ安徽分离株的Ｎｓｐ２高变区和ＯＲＦ５序列测定的讨论与分析自１９９６年我国科研人员首次在国内分离到美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒以来，各地不断有新的地方株的报道。且分离毒株出现了基因变异和缺失现象，说明该病毒在国内流行的多样性和高变异性。但２００６年国内暴发“猪高热病”后所分离的ＰＲＲＳＶ毒株Ｎｓｐ２基因的同源性很高，与美洲型标准毒株ＶＲ．２３３２相比，都在Ｎｓｐ２的第４８２位缺失１个氨基酸和在第５３４位至第５６２位有２９个氨基酸的缺失，而本研究所分离的毒株测序结果表明５个安徽省地方株Ｎｓｐ２基因也在相同位置共缺失３０个氨基酸，符合引起“猪高热病”的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的特征【６２１。本研究所分离毒株的进化树分析表明：随着ＰＲＲＳＶ在中国的不断传播，其变异程度不断提高，与传统美洲型毒株的距离越来越远，系统进化树分析表明在中国分离的ＰＲＲＳＶ毒株按照两种不同的途径进化：一种是以ＢＪ４、Ｓｌ为代表，与美洲型标准毒株ＶＲ一２３３２距离较近，与ＶＲ－２３３２属同一分支的一个亚群；另外一种是以ＨＵＮ４、ＪＸＡＩ为代表的，都是在暴发“猪高热病’’后分离的毒株，包括安徽省省５个分离株在内，与中国分离的高毒力毒株ＣＨ—ｌａ属于同一亚群，进化树分析显示目前中国分离的变异株极有可能来源－］：ＣＨ．１ａ毒株［６３，６４１。这些结果表明：安徽省５个地区ＰＲＲＳＶ分离株的Ｎｓｐ２和ＧＰ５序列基本一致，均为美洲株变异株，目前没有发现欧洲株，显示了安徽省发生的ＰＲＲＳ与近期周边的江西、湖北、山东省及国内流行的ＰＲＲｓｖ有高度的相关性嘲，也进一步证实了有关研究提出的ＰＲＲＳＶ在猪群问的传播过程中，Ｎｓｐ２、ＯＲＦ５易发生变异的观点，同时明确了安徽分离株与ＰＲＲＳＶ其他毒株的亲缘关系，为今后防控该病选用和研发疫苗的奠定了基础惭ｌ。４．３对猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株致病性研究的讨论与分析经典的ＰＲＲＳＶ主要是引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，和仔猪的呼吸道症状，但２００６年爆发的“猪高热病”出现许多成年猪死亡的病例。本试验所用的ＳＣＨ０７毒株根据基因测序结果为美洲型ＰＲＲＳＶ变异株，致病性试验结果表明：试验接毒猪出现与“猪高热病”极为相似的症状，该毒株能够引起仔猪明显的ＰＲＲＳ临床症状和大体病变：出现了持续高热、猪体温升高持续１５ｄ～１８ｄ，发病猪耳根、腹部皮肤发红、呼吸困难的症状，剖检肺脏和脾脏都有明显的病变。发病率达１００％，死亡率为５０％，且从攻毒后死亡试验猪的肺脏和耐过试验猪的血清中均可检ＮＮＰＲＲＳＶ变异株。本研究结果与近期报道的高致病性ＰＲＲＳＶ变异株人工感染猪的试验结果基本一致【６。７１，但与国内早期的ＰＲＲＳＶ人工感染试验的临床症状不明显和不引起死亡的结果有一定区别，说明变异株致病性增强。本研究的病理组织学观察发现，ＰＲＲＳ的主要病变在肺脏、脾脏和淋巴结。肺脏出现以肺泡膈增宽和伴有巨噬细胞增生为特点的问质性肺炎１６引，这可能是试验猪出现呼吸困难的直接原因之一。通过病理组织学观察我们发现病猪全身淋巴结、脾脏的淋巴组织严重出血、坏死严重，验证了ＰＲＲＳ是免疫抑制性疾病。会造成机体细胞免疫机能降低，易导致继发感染其他疾病。目前，ＰＲＲＳ的治疗还没有特效药，其防控主要依赖免疫疫苗，在生产实践中，用ＰＲＲＳＶ疫苗的免疫效果不是很理想，可能与ＰＲＲＳ是免疫抑制性疾病，或者是猪群本来就存在免疫抑制性疾病的隐性感染，免疫系统受到破坏有关，但本研究在实验过程中发现：在接毒后第１５ｄ，用相同毒价、方法和２倍剂量对耐过猪重新接毒一次，两天后，接毒猪只表现出轻微的症状，后逐渐康复。说明耐过猪体内的抗体水平己能抵御强毒的侵袭，因此，预防该病所选用的疫苗株和当地流行毒株基因组的吻合率，应引起重视。结论ｌ、应用细胞培养和ＰＣＲ等方法，从安徽省“高热病”病猪分离鉴定５株猪繁殖呼吸综合征病毒变异株ＳＣＨ０７、ＤＹ０７、ＦＸ０７、ＳＺＨ０８和ＨＳＨ０８。２、对Ｎｓｐ２和ＯＲＦ５序列分析表明，安徽省ＰＲＲＳＶ分离株与国内变异毒株ＪＸＡＩ、ＨｕＢｌ高度同源，均属于美洲型变异毒株。３、分离株Ｎｓｐ２基因中３０个不连续核苷酸的缺失可能导致其对猪的致病力明显增强，与安徽省猪“高热病”广泛流行密切相关。３５参考文献【Ｉ】ＢｉｌｏｄｅａｕＲ【２】ＷｅｎｓｖｏｏｒｔＤｅａＳ，ＭａｒｔｉｎｅａｕＧＰ’ｅｔａ１．ＰｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎＱｕｅｂｅｃ阴．ＶｅｔＲｅｃ，１９９１，１２９（３）：１０２－１０３．Ｇ，ＴｔｅｒｐｓｔｒａＣ，ＰｏｌＪＭＡ，ｃｔａ１．ＭｙｓｔｅｒｙｓｗｉｎｅｄｉｓｅａｓｅｉｎｔｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＬｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓ．ＶｅｔＱｕａｒｔｅｒｌｙ，１９９１，１３（３）：１２１－１３０【３】张志成，钟文彬．地区猪繁殖与呼吸道征候群Ｉ病毒鉴定【Ｊ】．中华兽医杂志，１９９３，１９（４）：２６８—２７６．【４】郭宝清，陈章水，刘文兴．从疑似ＰＲＲＳ流产胎儿分离猪生殖与呼吸综合征病毒的研究【Ｊ１．中国畜禽传染病，１９９６，８７（２）：１．５．【５】杨汉春，管山洪，尹小敏，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定［Ｊ】．中国兽医杂志，１９９７，２３（１０）：９－１０．【６】董永毅，姜平，韩庆安，等．华东某猪场猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防制【Ｊ】．畜牧与兽医，２０００，３２（３）：６—７．【７】宁宜宝，郑杰，张纯萍，等．我国南方猪高热病的研究（ＩＩ卜猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的分离、鉴定和致病性测定【Ｊ】．中国兽药杂志，２００７，４（１）：１４．１８．【８】童光志，周艳君，郝晓芳，等．高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析【Ｊ】．中国预防兽医学报，２００７，２９（５）：３２３．３２７．【９】陆承平主编，兽医微生物学（第三版）【Ｍ】，北京：中国农业出版社２００１，５５４．５５５．【１０】Ｂｅｎｆｉｅｌｄ【ｌｌ】ＫｉｍＤＡ，ＮｅｌｓｏｎＥ，ＣｏｌｌｉｎｓＪＥ，ｅｔａ１．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｗｉｎｅｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＡＴＣＣｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＩＲＳ）ｖｉｒｕｓ（ｉｓｏｌａｔｅＨＳ，ＫｗａｎｇＪ，ＹｏｏｎＶＲ·２３３２）［Ｊ１，ＶｅｔｉｎＤｉａｇｎＩｎｖｅｓｔ，１９９２，４（２）：１２７－１３３．ＬＪ，ｃｔａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄａｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｌｎｅ（ＰＲＲＳ）ＶｉｌａｌＳＪＪｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＭＡ一１０４ｃｅｌｌｌｉｎｅ［Ｊ］．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，１９９３，１３３：７７４８３．【Ｉ２】Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ【１３】Ｓｈｅｎ诵ⅡｌＭ，ＰｅｔｅｒｓｅｎＢｅｓｔｅｎＡ，ｄｅＫｌｕｙｖｅｒＥｅｔａ１．ＭｏｅｌｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＬｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，５５：１９７－２０２．Ｓ，ＫｗａｎｇＪ，ＬｉｕＷｅｔａ１．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｏｆＰｏｒｃｉｎｅａｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮｓｐ２ｇｅｎｅＶｉｒｏｌ，２０００，１４５：８７１－８８３．ｕｎｉｑｕｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎ［Ｊ】．Ａｒｃｈ【１４】ＭｅｎｇＸＪ，ＰａｕｌＰＳ，ＨａｌｂｕｒＰＧ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅＹ－ｔｅｒｍｉｎａｌｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅＧｅｎＶｉｒｏｌ，１９９４，７（７）：１７９５—１８０１．ｖｉｒｕｓ明．【１５】ＫｅｇｏｎｇＴｉａｎ，ＸｉｕｌｉｎｇＹｕ，ＴｉｅｚｈｕｏｕｔｂｒｅａｋｓｏｆａｔｙｐｉｃａｌＰＲＲＳＺｈａｏｅｔａｌＥｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｆａｍｌＰＲＲＳＶｉｎＣｈｉｎａａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｖａｒｉａｎｔｓ：ｕｎｐａｒａｌｌｅｌｅｄｏｆｔｈｅｕｎｉｑｕｅｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｈａｌｌｍａｒｋ．【Ｊ１．Ｐｌｏｓｏｎｅ，２００７＂２（６）：Ｉ一１０．【１６】ＭｅｎｌｅｎｂｅｒｇＪＪＭ，ＢｅｓｔｅｎＡ，ＫｌｕｙｖｅｒＥＰ，ｅｔ２ｔｏ７ｏｆＬｅｌｙｓｔａｄａ１．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｅｎｃｏｄｅｄｂｙａＯＲＦｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｋｏｌｏｇｙ，ｌ９９６２０６（１）：１５５－１６３．ｓｉｚｔｈｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ【１７１ＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇＪＪＭ，ＰｅｔｅｒｓｅｎＤＢＡ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｏｆＬｅｌｙｓｔｅｄｖｉｒｕｓ：ｔｈｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＧＰ２ｅｎｃｏｄｅｄｂｙＯＲＦ２ｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｉｎｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅ［Ｊ］．Ｖ＇ｔｒｏｌｏｇｙ，１９９６二２５（１）：红５１．１１８１仇华吉，周彦君，童光志．猪繁殖２呼吸综合征病毒蛋白的结构与功能【Ｊ】．动物医学进展，２０００，１２（２）：２３．２６．【１９】ｖａｌｌＮｉｅｕｗｓｔａｄｔＡＰ，ＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇＪＪＭ，ＶａｎＥｓｓｅｎ－ＺａｎｄｂｅｒｇｅｎＡ，ｅｔａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｎｃｏｄｅｄｂｙｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ３ａｎｄ４ｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆＬｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓ（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）ａｒｃｓｔｒｕｃａｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｔｈｅｖｉｒｉｏｎ【Ｊ】．Ｊ［２０】ＺｈａｎｇＹ，ＳｈａｎｎａＲＶｉｒｏｌ，１９９６，７０：４７６７－４７７２．ＳｅｔＤ，ＰａｕｌＰｏｎａｉ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｐｉｔｏｅｓｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｖｉｉ＇ｕｓ［Ｊ］．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，ｌ９９８，６３：１２５—１３６．【２ｌ】仇华吉，童光志，郭宝清，等．猪生殖．呼吸综合征病毒（ＰＲＲｓｖ）ＣＨ．１ａ株ｏＩｔＦ５分子分析【Ｊ】．中国畜禽传染病，１９９８，２０（增刊）：７９．８３．【２２】ＭｕｒｔａｕｇｈＭＰ，ＥｌａｍＭ［２３】ＷｉｓｓｉｎｋＧＰ２ａＰ，ＫａｋａＬＴ．ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＶＲ－２３３２ａｎｄＬｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｓｏｆｔｈｅＰＲＲＳＥＨＪ，Ｋｒｏｅｓｅｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，１４０：１４５１—１４６０ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｏｆｔｈｅＭＶ，Ｍａｎｅｓｃｈｉｊｎ—ＢｏｎｓｉｎｇＪＧｃｔａ１．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｒｉｍｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＧｅｎＶｈ－ｏｌ，２００４，８５：３７ｏｆｖｉｒｕｓ·ｉｎｄｕｃｅｄ１５—３７２３．Ｃ，ｅｔａ１．Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｌａｍｅ５ｏｆａｓａｃａｕｓｅａｎｄＧＰ５ｆｏｒｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｖｉｒｕｓ［２４】ＳｕａｒｅｚＰ＇Ｄｉａｚ－ＧｕｅｒｒａＭ，Ｐｒｉｅｔｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．ＧＰ５ｏｆＶｉｒｏｉ．ｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ１９９６，７０（５）：２８７６－２８８２【２５］ＧａｇｎｏｎｖｉｒａｌＣＡ，ＬａｃｈａｐｅｌｌｅＧＬａｎｇｅｌｉｅｒＹｅｔａ１．Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｄｉｆｆｅｒｓｉｎｉｔｓｃｅｌｌｕａｒｍａｔｕｒａｔｉｏｎｆｒｏｍａｕｔｈｅｎｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｂｕｔｍａｉｎｔａｉｎｓｋｎｏｗｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ】．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，２００３，１４８：９５１－９７２．［２６】ＫｒｃｕｔｚＬＣ，ＭｅｎｇｅｌｉｎｇＷｏｆＬｍａｊｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ［２７】ＭａｒｄａｓｓｉＨ，ＭａｓｓｉｅｅｎｃｏｄｅｄｂｙＯＲＦｓＢａｃｕｌｏｖｉｒｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ【Ｊ】．ＶｅｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，５９：ｌ一１３．Ｂ，Ｄｅａ５ｔｏ７Ｓ．Ｉｎｗａｃｅｌｌｕｌａｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｉｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｎｌｓ［Ｊ】．ａｎｄＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９６，２２１：９８－ｌ１２．［２８】ＤｅａＳ，ＧａｇｒｏｎＣＡ，ＭａｒｄａｓｓｉＨ，ｅｔａｉ．ＡｎｔｉｇｅｎｉｃｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙａｍｏｎｇＮｏｒｔｈＡｌ－ｎｅｒｉｃａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅａｓＥｕｒｏｐｅａｎｓｔｒａｉｎｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｄｅｆｉｎｅｄｂｙｍｏｎｏｅｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｔｈｅｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎ【Ｊ】．ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｉｏｌ，１９９６，３４（６）：１４８８－１４９３．Ｈ，ｅｔａ１．Ｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｈｕｍｏｍｌｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｔｈｅ［２９】ＬｏｅｍｂａＨＤ，ＭｏｕｎｉｒＳ，ＭａｒｄａｓｓｉｍａｊｏｒＶｉｒｏＬｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｔｈｅｐｒｏｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ１９９６，１４１：７５１－７６１．ａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ【Ｊ】．Ａｒｃｈ［３０】ＬｅｅＣ，ＣａｌｖｅｒｔＪＧ，ＷｅｌｃｈＳｉａｏＫｕｎＷ，ｅｔａ１．ＡＤＮＡ—ｌａｕｎｃｈｅｄｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｏｒｃｉｎｅ［３１】ＢａｕｔｉｓｔａｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｖｉｒｕｓＥＭ，ＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇＪＪｉｎｆｅｅｔｉｖｉｔｙ［Ｊ】．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５，３３：１４７—１６２．ＣＳ，ｅｔａ１．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｏｆｔｈｅＭ，ＣｈｏｉＡｍｅｒｉｃａｎ（ＶＲ－２３３２）ｓｔｒａｉｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，１９９６，１４１：１３５７—１３６５．ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＲＲＳ）ｖｉｒｕｓ叨．ｔｏ【３２】ＮｅｌｓｏｎＥ八Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ－ＨｅｎｎｉｎｇｓＪＴ，ＢｅｎｆｉｅｌｄＤＡ．Ｓｅｒｍｎｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＲＲＳ）ｖｉｒｕｓ【Ｊ】．ＪＶｅｔＩｎｖｅｓＬ１９９４，６：４１０－４１５．ｔｈｅＤｉａｇｎ【３３】ＧａｏＺＱ，ＧｕｏＸ，ＹａｎｇＨＣ，ＧｅｎｏｍｉｃＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏＣｈｉｎｅｓｅｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ【Ｊ】．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，２００４，１４９：１３４１—１３５１．ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａ【３４】ＷｏｏｔｔｏｎＳ，ＹｏｏＤ，ＲｏｇａｎＤ．Ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈＣａｎｄｄｉａｎｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳＶ）ｉｓｏｌａｔｉｏｎ【Ｊ】．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，１４５：２２９７—２３２３．【３５】高志强，郭鑫，杨汉春，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异株的基因组特征【Ｊ】．畜牧兽医学报。２００５，３６：５７８．５８４．【３６】ＯｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚＭＢ，Ｂｏｔｈｅｒ凡Ｔｏｉｌｓｙｎｄｒｏｍｅ［３７】ＰｉｒｚａｄｅｈｖｉｒｕｓＰ，ｅｔａ１．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈａｎｔｉｂｏｄｙ托：Ｓ】弧ｍｓｅｔｏａｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｉｎｔｈｅＯＲＦ３ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌＢ，ＧａｇｎｏｎＣＡ，Ｄｅａｇｌｙｅｏｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，２６７（２）：１３５．１４０．Ｓ．ＧｅｎｏｍｉｃａｎｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｍａｊｏｒｅｎｖｅｌｏｐｅＧＰ５ａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ１９９８，６２：１７０－１７７．ｖｉｒｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．ＣａｎＪＶｅｔＲｅｓ，【３８】ＳｕａｒｅｚＰ，ＺａｒｄｏｙａＲ，ＭａｒｔｉｎＭＪ，ｅｔａ１．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆＥｕｒｏｐｅａｎｓｔａｉｎｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｉｎｆｅｒｒｅｄｆｒｏｍＤＮＡａｎｄＯＲＦ７ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｕｍｔｉｖｅＯＲＦ５ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＶｉｒｕｓＲｅｓ，１９９６，４２：１５９－１６５．【３９】张建武，庄金山，袁世山．中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究．中国畜牧兽医学会动物传染病分会第三届猪病防控学术研讨会论文集【Ｃ】．２００８：１４９—１５３．［４０】ＭａｇａｒｐｏｒｃｉｎｅＲ，ＬａｒｏｃｈｅｌｌｅＲ，ＤｅａＳ，ｅｔａ１．ＡｎｔｉｇｅｎｉｃｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＣａｎａｄｉａｎａｎｄＵＳｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｎｓｕｓｉｎｇＪＶｅｔＲｅｓ，１９９５，５９（３）：２３２—２３４．ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔＯｔｈｅｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］。Ｃａｎ【４ｌ】ＢａｕｔｉｓｔａＣＬ２６２１ＥＭ，ＧｏｙａｌＳＭ，ＹｏｏｎＩＪ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅａｌｖｅｏｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓａｎｄａｎｔｉ—ＰＲＲＳａｎｔｉｂｏｄｙ【Ｊ】．ＪＶｅｔＤｉａｇｎＩｎｖｅｓｔ，１９９３，５：１６３．１６５，【４２】ＤｅａＳ，ＴｈｅｒｒｉｅｎＤ，ＣｏｒｎａｇｌｉａＥ，ｅｔａ１．ＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＥＬＩＳＡｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｍｏｄｉｅｓｔＯＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｉｒａｔｏｒｙＮｕｃｌｅｏｅａｐｓｉｄＰｒｏｔｅｉｎａｓＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｏｌＶｉｒｕｓＵｓｉｎｇＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ最ｃｏｌｉ．ｅｘｐｒｅｓｓｅｄＡｎｔｉｇｅｎ［Ｊ】＋ＪＭｅｔｈｏｄｓ，２０００，８７（１／２）：１０９—１２２．【４３】，张鹤晓，甘孟侯，等．ＩＰＭＡ检测猪生殖和呼吸综合征病毒抗体的研究【Ｊ】．中国兽医杂志，１９９６，２２（１２）：３．５．ｆ４４】谭斌，刘长明，危艳武，等。ＰＲＲＳＶ－ＩＰＭＡ抗体检测试剂盒的研制及其应用【Ｊ】．中国兽医科学，２００６，３６（１１）：８８０—８８４．【４５】ＹｏｏｎＬＪ，ＪｏｏＨＳ，ＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎＷｔｏＴ，ｅｔａ１．ＡｎＩｎｄｉｒｅｃｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｓｔｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＳｗｉｎｅＩｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙａｎｄＲｅＳｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓｉｎＳｗｉｎｅＳｅｒａ【Ｊ１．ＶｅｔＤｉａｇｎｌｎｖｅｓｔ，１９９２，４：１４４—１４７．［４６】彭长凌，高崧，刘秀梵．ＰＲＲＳＶ间接免疫荧光检测法的建立和应用【Ｊ】中国兽医科技，２００５，３５（４）：２５６－２６０【４７】ＫｏｎｏＹ，ＳｈｉｍｉｚｕＭ，Ｙａｍａｄａｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ９４１－９４６ａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳ，ｅｔａ１．ＮｅｓｔｅｄＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎａｎｄｔｙｐｉｎｇｏｆｐｏｒｃｉｎｅ０）：ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＲＲＳ）ｖｉｒｕｓｐｉｇｓ［Ｊ］．ＪＶｅｔＭｅｄＳｃｉ，１９９６，５８（１【４８】宋志军，宋长绪，杨增岐，等．猪生殖与呼吸综合征病毒ＴａｑＭａｎ荧光定量Ｉ汀一ＰｃＲ检测方法的建立【Ｊ】冲国兽医科学，２００６，３６（２）：９８．１０２．Ｄ９】ＳｕｒＪＨ，ＣｏｏｐｅｒＶＬ＇ＧａｌｅｏｔａＪ人ｅｌａ１．ＩｎｖｉｖｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄａｔｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＲＮＡｂｙｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９６，４（９）：２２８０—２２８６ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓｐｏｓｔｉｎｆｅｅｔｉｏｎ［Ｊ］．【５０】ＣｈｕｅｈＬＬ．Ａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＪＶｉｒｌｏＭｅｔｈｏｄｓ，１９９９，Ｍａｙ，７９（２）：ｌ３３—１４０【５ｌ】任慧英，杨汉春，高云．猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸在仔猪呼吸及繁殖系统动态分布３８的研究【Ｊ】．中国兽医杂志，２００２，３８（２）：３－４【５２１郭宝清，蔡雪晖，刘文兴，等．猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的研制ｆＪｌ．中国预防兽医学报，２０００，２２（４）：２５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魏建忠教授的悉心指导下完成的，导师丰富渊博的专业知识，严谨务实的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，平易近人的人格魅力对我影响深远、终身受益。文章从选题、实验设计至最终完成，无不凝集着导师的智慧和心血，在此，我谨表示诚挚的谢意和崇高的敬意。衷心感谢传染病实验室李郁、孙裴两位老师的无私奉献，在学习上给予的指导和生活上的关心。我也衷心的祝愿两位老师身体健康，工作愉快！本论文在实验过程中得到安徽省动物疫病预防控制中心的大力支持，衷心感谢中心的朱良强主任等领导，为我提供优良的实验条件，使我的试验得以顺利完成，也向该站化验室詹松鹤主任、江定丰、何长生、郑举等师兄及全体工作人员在实验中给予的热情帮助表示诚挚的谢意；同时也感谢南京天邦生物科技公司张小飞研究员在我实验最困难时期的及时帮助。感谢动物科技学院的余为一教授、李槿年教授、李培英教授、陶勇副教授、潘玲副教授、余培英老师、张丽霞老师在我读研期间的关心和指导。同样的调｝意献给储照龙、王非、谢玉洁、秦璐璐、李春芬、赵磊、黄显明、廖俊伟、张吉贵、陈申秒、丁维民、苏金存、李超、刘大伟、张玮、谢玉柱、王星辰等师兄弟们，感谢他们的帮助和支持；感谢三年来彼此同甘共苦的快乐时光。借此机会，请允许我向多年来始终给予我理解和支持，并且一直为我默默奉献和付出心血的单位领导、同事、亲属、爱人和可爱的女儿表示最深情的敬意！他们的无私奉献与支持，是我坚持不懈并继续向前的动力。最后向参加论文评审和答辩的各位专家、教授致以崇高的敬意和衷心的感谢！２００９年５月于合肥个人简介杨德康，男，１９７５年５月出生，安徽肥东人，兽医师，１９９９年毕业于安徽农业大学兽医专业，后供职于安徽省肥东县畜牧中心，２００６．９．至今，就读于安徽农业大学动物科技学院预防兽医学硕士点。在读期间，获校第四届“研究生学术论坛”优秀论文评选二等奖，发表论文两篇。附：在读期间发表论文１．杨德康，李郁，王桂军，等．高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定［Ｊ】畜牧与兽医，２００９，４１（５）：７８＿８０．２．王金华，杨德康．雏鸡白痢沙门氏菌的诊治［Ｊ】．中国禽业导刊，２００８，２５（１３）：３５．４７PRRSV变异株的分离鉴定及生物学特性的研究

作者：

学位授予单位：

杨德康

安徽农业大学

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6.宋志军,宋长绪,杨增岐,朱道中,武占银,蒋智勇,林志雄,刘燕玲,张福良 猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[期刊论文]-中国兽医科学 2006(02)

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引用本文格式：杨德康 PRRSV变异株的分离鉴定及生物学特性的研究[学位论文]硕士 2009