酶联免疫吸附试验中常见问题及解决方法_张文艳

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药物与临床酶联免疫吸附试验中常见问题及解决方法

张文艳１　　胡红霞２

（１．河南省开封市陇海医院；　２．河南省开封市第五人民医院　　河南开封　　４７５００３）

【摘要】　目的　　探讨酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）中常见的影响因素。方法　　我们对日常操作中各个环节常出现问题进行原因分析，并总结解决办法。结果　　ＥＬＩＳＡ试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等，出现假阴性或假阳性结果。结论　　酶联免疫吸附试验以灵敏度高、特异性好等特点，在临床上得到了广泛的应用，但试剂的选择、标本溶血、污染以及操作中各环节均可能影响测定结果，应严格按照操作步骤，注意细节，同时作好室内质控、室间质评，才能保证检测质量。【关键词】酶联免疫吸附试验　　影响因素　　解决办法【中图分类号】Ｒ４４６．６【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７４－０７４２（２００９）１１（ｂ）－００８０－０１ＥＬＩＳＡ是２０世纪７０年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，但影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨如下。１　　试剂的因素

要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，严格按照说明书进行操作。注意在ＥＬＩＳＡ测定中将试剂盒在室温下放置２０～３０ｍｉｎ后再进行测定，如从冰箱中拿出来即用可造成弱阳性标本的检测出现假阴性。　

２　　样本的因素　　２．１　　内源性干扰因素

包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等［１］可与固相上包被的特异抗体ＩｇＧ以及随后加入的酶标的特异抗体ＩｇＧ结合，从而出现假阳性结果。２．２　　外源性干扰因素

包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。

２．２．１　　标本溶血　　血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）为标志的ＥＬＩＳＡ测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的ＨＲＰ底物反应显色，故严防标本溶血。

２．２．２　　标本的保存　　标本污染可使实验出现非特异性显色。反复冻融在用间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。因此，ＥＬＩＳＡ检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，５ｄ之内应４℃保存，长时冻存的样本避免反复融冻［２］。

２．２．３　　标本凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原，可使结果呈假阳性。解决的方法有：将采集后的血液放入３７℃水浴中１ｈ，待充分凝固后再离心分离血清［３］。３　　操作中的因素　　３．１　　加样

孵育前加样时间过长，酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量不准，都可导致试验结果不准确。控制方法：（１）实验样本过多时，可分批次操作，以减少实验时间延长造成的误差；（２）加酶试剂后，用吸水纸吸干孔外试剂；（３）作定量试验时，加样器应定期校准。３．２　　温育的时间、温度

常用试剂盒为３７℃３０ｍｉｎ～１ｈ。为了避免标本或稀释液蒸发，注

　【收稿日期】２００９－０６－１２

意孵育时贴封片或加盖，直接将微孔板浮于水浴箱的水中可受热均匀，有效避免“边缘效应”。若温育时间不够，易致弱阳性标本测不出来。３．３　　洗板

一般有２种方式，即手工和洗板机洗板。采用手工洗板，孔与孔之间液体易交叉，采用半自动洗板机时，洗液量不足导致洗板不彻底，洗板针堵塞导致抽吸不完全，洗板不畅导致清洗效果差。控制方法：（１）手工洗板时，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；（２）洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅，若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出；（３）为了洗涤效果好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板１～２次，或适当增加洗板的次数，有资料报道洗板７次能达到理想的洗涤效果［４］。３．４　　显色

ＥＬＩＳＡ试剂盒中以四甲基联苯胺（ＴＭＢ）为底物，提供的底物为Ａ和Ｂ２瓶应用液，不需避光，但应尽量避免接触金属器械。３．５　　终止

　避免加终止液时产生较多气泡而致假阳性增加。３．６　　结果判定

定量测定时用酶标仪读取结果，在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸，保持酶标板清洁。酶标仪不应置于阳光或强光照射下，需先预热１５～３０ｍｉｎ再进行测试。

综上所述，尽管ＥＬＩＳＡ法操作简单，但可能影响测定结果的因素也较多。故在实际操作的过程中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。认真避免或减少影响因素，力求结果准确，为疾病的诊断和科研提供可靠的依据。参考文献　　

［１］　李宁．影响酶联免疫吸附实验测定的关键环节［Ｊ］．检验医学与临床，

２００６，３（７）：３１４～３１５．

［２］　李会英．酶联免疫吸附实验影响因素的分析［Ｊ］．检验医学与临床，

２００７，４（１０）：９８５～９８６．

［３］　程玉萍．标本收集对酶联免疫吸附实验检测结果的影响因素分析［Ｊ］．

山西医药杂志，２００４，３３（５）：４１２．

［４］　罗俊．ＥＬＩＳＡ检测时洗板机洗板对检测结果的影响［Ｊ］．江西医学检

验杂志，２００５，２３（２）：１８０．

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