N的测定步骤

2SO4用

NaOH中和生成氢氧化铵，加热分解成氨。经硼酸吸收后，用标准酸滴

定计算含氮量。

反应：样品消化：H2SO4→ SO3 +H2O+[O]

含氮有机物 + [O] → CO2↑+H2O↑+NH3 2NH3+H2SO4 → (NH4)2SO4

氮的蒸馏：(NH4)2SO4 + 2NaOH→2NH3↑+Na2SO4+2H2O 氨的吸收与滴定：2NH3+4H3BO3→ (NH4)3B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

为了促使样品迅速分解，在硫酸中加入硫酸钾以提高反应温度，同时加入硫酸铜作催化剂以加速反应。

2 试剂

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 2.1 硫酸铜。 2.2 硫酸钾。 2.3 硫酸。

2.4 2%硼酸溶液。 2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 2.6 40%氢氧化钠溶液。

2.7 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。 3 仪器

定氮蒸馏装置：如图所示。

凯氏定氮法仪器1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管

10.蒸汽发生瓶

4 操作方法

1、 样品处理：精密称取0.12g固体样品，移入干燥的100ml或250ml定氮瓶中，加入0.3g助消化剂及4毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加10ml水，放冷后，移入50ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同的方法做试剂空白试验。

2、 按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加数滴浓硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

3、 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂2-3滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取25.00ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以5ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，接收蒸馏液70ml。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N盐酸标准溶液定至灰红色或微红色为终点。 同时吸取25.00ml试剂空白消化液按3操作。 计算：

X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（25/50）) *100% X：样品中蛋白质的百分含量，g；

V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml； N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； m：样品的质量（体积），g（ml）；

注意事项

（1） 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。 （2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

（3） 消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。

（4） 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

（5） 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

（6） 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

（7） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

（8） 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

（9） 吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。

（10） 以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，

亦可免去用移液管，操作比较简便。

（11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物[Cu(NH3)4]2+

（12） 这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。