PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立_郑逢梅

ＰＥＤＶ流行株Ｎ基因主要抗原表位原核表达及ＥＬＩＳＡ方法的建立

赵　军，霍金耀，李　欢，杨　霞，陈　陆，常洪涛，王新卫，刘红英，杜季梅，姚慧霞，王川庆＊　　　郑逢梅，

）（河南郑州４河南农业大学，５０００２

为建立检测猪流行性腹泻病毒（应用Ｒ摘要：ＰＥＤＶ）Ｎ蛋白抗体的ＥＬＩＳＡ方法，ＴＣＲ从腹泻仔猪样本中扩增获得－Ｐ了１段Ｐ根据对其氨基酸序列的抗原性分析结果，将Ｎ基因上２个大的抗原表ＥＤＶ河南流行毒株Ｎ基因全长序列，，（）位区（克隆至原核表达载体ｐ构建ｐ中。１３３１２２１位氨基酸）Ｔ２ＥＴ２Ｌ２１ＤＥ３Ｅ－－－Ｎ重组质粒并转化至宿主菌Ｂ～３αα将重组菌在３表达产物为融合蛋白，相对分子质量约７℃条件下加入ＩＰＴＧ进行诱导使该蛋白获得了高效表达，。Ｗ所表达的蛋白可与抗Ｐ４ｂ１３００ｅｓｔｅｒｎｌｏｔ分析表明，ＥＤＶ全病毒小鼠阳性血清发生反应。以纯化的重组Ｎ蛋白－　／孔，，血清最佳稀释度为１∶１作为包被抗原建立了检测Ｐ抗原最佳包被量０ＥＤＶ抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法，．２２６μ００ｇ，二抗最佳稀释度为１待检血清Ｄ∶２０００．２８判定为阳性。国内首次用该方法对临床猪血清样本进行了检０　５０值≥４／），／）。结果表明，测，母猪血清Ｐ仔猪血清阳性率为２建立的间接ＥＤＶ抗体阳性率为８４．２６％（１６６１９７７．９３％（３１１１１灵敏性和可重复性良好，可用于临床上ＰＥＬＩＳＡ方法特异性、ＥＤＶ抗体水平的监测和ＰＥＤ流行病学调查。关键词：抗体监测原核表达；免疫原性；间接ＥＰＥＤＶ；Ｎ基因；ＬＩＳＡ；

（）中图分类号：Ｓ８５２．６５　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００５５４５２０１４０３３７１８４００－－－ｅｎｅｍａｏｒａｎｔｉｅｎｒｅｉｏｎｏｆＰＥＤＶａｎｄｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｒｏｋａｒｏｔｉｃｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＰ　　　　　　　　　　　ｇｊｇｇｐｙｐ

ｒｏｔｅｉｎｏｆａｎｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡｂａｓｅｄｏｎｅｘｒｅｓｓｅｄ　　　　　　　ｐｐ　

，，，，ａＺｔＨＥＮＧＦｅｎｅｉＺＨＡＯＪｕｎ，ＨＵＯＪｉｎｏＬＩＨｕａｎ，ＹＡＮＧＸｉａＣＨＥＮＬｕ，ＣＨＡＮＧ　Ｈｏｎａｏ－ｍ－ｙ－　　　　　　ｇｇ

＊

，，，，ｉｉｘＨＡｒＷＡＮＧＸｉｎｅｉＬＩＵ　ＨｏｎｎＤＵＪｉｅｉＹＡＯ　ＨｕｉｉａＷＡＮＧＣｈｕａｎｎｅｎａｎ　ｉ－ｗ－－ｍ－－ｑ－　　　ｙｇｇｇ　（ｇｃＵＺＣｕｌｔｕｒａｌｎｉｖｅｒｓｉｔｈｅｎｚｈｏｕ４５０００２，ｈｉｎａ）　ｙ，ｇ：，ＰＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｅａｎｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡｔｏｄｅｔｅｃｔａｎｔｉＥＤＶａｎｔｉｂｏｄｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅＮ－　　　　　　　　　　　　ｐｙｐ

，ｒｏｖｉｎｃｅｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｓｅｕｅｎｃｅｄａｎｄａｎａｌｚｅｄ．ＴｗｏｍａｏｒａｎｅｎｅｓｏｆＰＥＤＶｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ　Ｈｅｎａｎ－　　　　　　　　　　　ｐｑｙｊｇ

ｔＰｅｎｅｗａｓａｍｌｉｆｉｅｄｂＲＴ－ＥＴｉｅｎｒｅｉｏｎｏｆＮＣＲａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ－　　　　　　　　　　　　　　ｇｇｇｐｙｐｐ　

，３３ＥＴａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌａｓｍｉｄｗａｓｎａｍｅｄａｓｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎ２２Ｆｕｓｉｏｎ－－Ｎ．　　　　　　　　　　αα　ｐｐｐｐ）ｗ３ａＢＬ２１（ＤＥ３ｉｔｈｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄＥＴ２ｎｄｉｎｄｕｃｅｄｂＩＰＴＧ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｈｔｏｆｔｈｅｒｅ　－－Ｎ－　　α　　　　　　　ｐｙｇ　ｃＰｒｏｔｅｉｎｗａｓａｂｏｕｔ４１３００ａｎａｌｚｅｄｂＳＤＳｏｍｂｉｎａｎｔＡＧＥ，ａｎｄｔｈｅｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｏｆ－　　　　　　　　　ｐｙｙｙ　　ｂｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂＷｅｓｔｅｒｎｌｏｔｗｈｅｎｍｏｕｓｅｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒｕｍａａｉｎｓｔ－　　　　　　　　　　ｐｙｐｇ　ＰＥＤＶ　ｗａｓｕｓｅｄ．ＡｎｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎａｎｔｉｂｏｄａａｉｎｓｔＰＥＤＶ　ｗａｓｄｅｖｅｌｏｅｄｂｕｓｉｎ　　　　　　　　ｇｙｇｐｙｇ　　　ｅｘｒｅｓｓｅｄＮｒｏｔｅｉｎａｓｃｏａｔｉｎａｎｔｉｅｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｔｉｍａｌｃｏａｔｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ　　　　　　　　　　ｐｐｇｇｐｇ　　

／，Ｎｒｏｔｅｉｎｉｓ０．２２６μｗｅｌｌａｎｄｔｈｅｏｔｉｍａｌｄｉｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｒｕｍｉｓ１∶１００ａｎｄｔｈａｔｏｆｔｈｅＨＲＰ－　　　　　　　　　　　　　　　ｐｇｐＳＤ４ＰＡｉｓ１∶２０００．ＴｈｅｏｓｉｔｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉｏｎｆｏｒｔｈｉｓＥＬＩＳＡａｓｓａｉｓ．２８．Ｗｈｅｎｆｉｅｌｄｓｅｒｕｍ　　　　　　　　　　　　ｐｙ５０≥０　

／）ｓａｍｌｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｗｉｔｈｄｅｖｅｌｏｅｄｔｈｅＥＬＩＳＡ，ｔｈｅｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｗａｓ８４．２６％（１６６１９７ｆｏｒｓｏｗ　　　　　　　　　　　ｐｐｐ／）ｓｅｒｕｍ，ａｎｄ２７．９３％（３１１１１ｆｏｒｉｌｅｔｓｓｅｒｕｍ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｄｅｖｅｌｏｅｄＥＬＩＳＡ　ｗａｓ　　　　　　　　ｐｇｐ

，，ｓｅｃｉｆｉｃｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｒｏｄｕｃｉｂｌｅａｎｄｓｕｉｔａｂｌｅａｓａｒａｉｄｓｅｒｏｌｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎ　　　　　　　　　ｐｐｐｇｙｇ　ＰＥＤＶａｎｔｉｂｏｄａｎｄｅｉｄｅｍｉｏｌｏｉｃｓｕｒｖｅｏｆＰＥＤ．ａｎｔｉ－　　　　ｙｐｇｙ　　：；；；ＫｅｗｏｒｄｓＰＥＤＶ；ＮｅｎｅｒｏｋａｒｏｔｉｃｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｍｍｕｎｏｅｎｉｃｉｔｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ；ａｎｔｉｂｏｄｍｏｎｉｔｏｒｉｎ　　　ｇｇｐｙｐｇｙｙｙ　　

ａＥ－ｍｗｃｏｒｒｅｓｏｎｄｉｎｕｔｈｏｒ，ａｉｌ：ｃｈｕａｎ６３．ｏｍ＊Ｃ＠１ｐｇｑ　

０００１３４８２　　收稿日期：－－，女，硕士。郑逢梅（９８８１－）　　作者简介：

：ａｉｌｗｃｈｕａｎ６３．ｃｏｍＥ－ｍ＠１＊通讯作者，ｑ

３７２

Ｊ　ＶＳ０１４年３月　第３４卷　第３期　Ｃｈｉｎ　ｅｔｃｉ　Ｍａｒ．２０１４　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　　中国兽医学报　２　］１１２４－。因此，备的报道，但均未见于实际应用［本

，ｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｏ　　猪流行性腹泻（　　ｐｐ

为猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤ）ｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｏ－　　ｐｐ，引起的接触性肠道传染病，临床ｒｈｅａｖｉｒｕｓＰＥＤＶ）　

上以猪的急性肠炎、呕吐、水样腹泻、脱水以及哺乳

１］

。所有年龄的猪均可感仔猪的高死亡率为特征［

研究利用ＰＣＲ技术扩增ＰＥＤＶ　Ｎ基因部分片段，通过原核表达获得重组Ｎ蛋白，作为包被抗原，初

为进一步步建立起检测ＰＥＤＶ抗体的间接ＥＬＩＳＡ，研制ＰＥＤＶＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒奠定了基础。　

染，但主要是危害未断乳仔猪，２周龄以内仔猪感染后死亡率高达９０％～１００％。目前该病广泛流行于

］６２－。亚洲和欧洲，给养猪业带来严重经济损失［

１　材料与方法

１．１　阳性样本来源　２０１１年本实验室收集的河南

某猪场腹泻仔猪粪便样本，经ＲＰＴ－ＣＲ方法检测为／／并命名为ＣＨＥＤＶ阳性，ＺＹ１１株。Ｐ

鼠源反转录酶ａＤＮＡ聚合酶、１．２　主要试剂　Ｔｑ　、、（Ｖ）ＮＡ酶抑制剂（ｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）ＲＭ－ＭＬＲ　

ＰＮＴＰ、ＭＤ１８ＶＤＦ膜载体均购自大连宝生物ｄ－Ｔ、ｐ工程有限公司，ＩＡａｍＶｉｒａｌＲＮＡ　ＭｉｎｉＫｉｔ购自Ｑ　　ｐ　琼脂糖购自ＳＩＡＧＥＮ公司，ｉｍａ公司，ｒａｄｆｏｒｄＱＢｇ

蛋白质定量试剂盒购自ＴａＩＡＮＧＥＮ公司，ｉｒＮ－Ａ－ｇ包涵体蛋白）纯化试剂盒、ｏｓｅＨｉｓ标签蛋白（ＡＢＤ　

显示试剂盒购自康为世纪公司，限ＮＡ连接酶、Ｔ４Ｄ制性内切酶ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏＥＢ公司，ＥＤＰⅠ购自Ｎ阳性、阴性血清由本实验室制备并保存。

３　ＰＣＲ引物的设计　参考ＧｅｎＢａｎｋ已公布的１．ＥＤＶＣＶ７７７株全基因序列（ｅｎＢａｎｋ登录号ＰＧ　）设计２对特异性引物。其中１对引物的Ｆ３５３５１１Ａ

扩增区域包括Ｎ基因全长；另１对引物用于扩增Ｎ基因上６并分别在上、下游引物中加３０ｂｐ的片段，，引物由上海入Ｂ表１）ａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ酶切位点（生工生物工程公司合成。

）成ＰｃＥＤＶ为甲型冠状病毒属（ｌｈａｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＡ－ｐ

，员，基因组全长约２编码３种主要结构蛋白：其８ｋｂ结构蛋白主要有相对分子质量为１８００００～２０００００　　、的糖基化纤突蛋白（７０００～３２０００糖基２Ｓ蛋白）　　化囊膜蛋白（和５７０００～５８０００的未糖基Ｍ蛋白）　　

］［９７－。其中，化ＲＮＡ结合核衣壳蛋白（Ｎ蛋白）Ｎ蛋

白在Ｐ在感染的ＥＤＶ的结构蛋白中所占比例最大，细胞中能得到大量表达，猪在感染ＰＥＤＶ的早期，体内就能产生抗ＰＥＤＶ　Ｎ蛋白的高水平抗体。鉴于冠状病毒Ｎ蛋白保守性强，所以利用Ｎ蛋白来建立ＰＥＤＶ分子生物学诊断技术具有很好的应用前景

［１０］

。

由于ＰＥＤＶ所引起的疾病与猪传染性胃肠炎在临床上难以区分，因此，对于ＰＥＤ的鉴别诊断需

［１］

首次要借助实验室手段。１９９０年，Ｈｏｆｍａｎｎ等１

报道使用完整的ＰＥＤＶ病毒粒子作为检测抗原建立了Ｅ但需要对ＰＬＩＳＡ方法，ＥＤＶ抗原进行纯化，所以操作比较复杂。另外，由于ＰＥＤＶ感染细胞后的繁殖滴度较低，所以抗原的大量制备比较困难。近年来尽管有不少关于Ｎ蛋白表达及其单克隆抗

表１　引物序列

引物名称Ｎ１５５４－ＦＮ１５５４－ＲＮｂｄ－ＦＮｂｄ－Ｒ

上游／下游上游下游上游下游

—３）引物序列（′′５

ＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡ　ＣＣＧＴＴＧＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡ

ＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧ　　ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣ　２６７０３～２７３４６　　

Ｎ基因

４４６

扩增区域２６２８６～２７８３９　　

目的基因Ｎ基因

产物长度／ｂｐ

１５５４　

下划线标注的碱基为添加的酶切位点扩增区域表示在ＣＶ７７７参考株中的位置；　　注：

１．４　样本处理及ＲＮＡ的提取　取病猪粪便或肠道

（／）进行５倍稀释后组织，用ＰＢＳ０．０１ｍｏｌＬ，Ｈ７．２　ｐ／充分研磨，反复冻融２～３次，００ｒｍｉｎ离心１０８０　ｍｉｎ取上清备用。参照说明书使用ＱＩＡａｍＶｉｒａｌｐ　

所提取ＲＲＮＡ　ＭｉｎｉＫｉｔ进行ＲＮＡ的提取，ＮＡ置　于－２０℃保存。

克隆及测序　５　反转录与ＰＥＤＶＮ基因的扩增、１．　

反转录体系为２０μＬ：ＲＮＡ模板１３μＬ，５×Ｂｕｆｆｅｒ４　／随机引物１μＬ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌＬ）１μＬ，０Ｌ（２μμ

／／，反转录ｍｏｌＬ）Ｎａｓｅ抑制剂（０ＵＬ）０．５μＬ，Ｒ４μμ

／酶Ｍ－ＭＬＶ（２００ＵＬ）０．５μＬ。反应条件为：２℃４μ

１．５ｈ，９５℃５ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增体系为５０μＬ：１０×／反转录产物２Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ，ＭＣｌ５ｍｍｏｌＬ）５μＬ，　ｇ２（μ

／（ＤＮＡ）５μＬ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌＬ）１μＬ，ＴａＤＮＡｃｑ　μ

／聚合酶０．引物ＮＦ、Ｎ２５μＬ，１５５４１５５４０ｍｏｌＬ）－－Ｒ（各１μ补加灭菌双蒸水至５Ｌ，０μＬ。反应循环参数：

；，然后９５℃５ｍｉｎ４℃１ｍｉｎ５５℃１ｍｉｎ，７２℃１．５９

，。将共３循环结束后再７ｍｉｎ２个循环；２℃１０ｍｉｎ

Ｊ　ＶＳ０１４年３月　第３４卷　第３期　Ｃｈｉｎ　ｅｔｃｉ　Ｍａｒ．２０１４　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　　中国兽医学报　２　回收目的片段ＰＣＲ产物进行１％琼脂糖凝胶电泳，

并连接至ｐ１８ＣＲ和ＭＤ－Ｔ载体。对重组质粒进行Ｐ酶切鉴定，阳性重组质粒送至北京华大公司测序，每个样本重复测序２次。

６　序列分析　利用ＭＥＧＡ４．０中的ｎｅｉｈｂｏｒ１．－ｇ

／／ｏｉｎｉｎＥＤＶＣＨＺＹ１１株及参考株Ｎ基　ｊｇ方法对Ｐ因进行遗传进化分析；利用ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ｈｔ－　

表２　ＰＥＤＶ参考毒株信息

毒　株／ＣＨ／Ｚ１Ｙ１ＨｕＮ　Ｐ５５ＢＪ２０１０／／ＣＨＧＤＳ０９／／ＣＨＨＮＨ０７／／ＣＨＩＭＴ０６ＬＺＣ　登录号Ｕｎｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｐＪＮ２４３７５８ＪＱ７２３７３１ＪＦ６９０７８０ＨＭ２１０８８２ＦＪ４７３３９４ＦＪ４７３３９１ＥＦ１８５９９２分离地及时间，Ｃｈｉｎａ２０１１，Ｃｈｉｎａ２０１１，Ｃｈｉｎａ２０１１，Ｃｈｉｎａ２０１０，Ｃｈｉｎａ２００９　，Ｃｈｉｎａ２００７，Ｃｈｉｎａ２００６，Ｃｈｉｎａ２００６毒　株／／ＣＨＳＨＨ０６２２００４ＪＳ－－／ＬＪＢ０３／ＣＨＳ　５８３Ｐ－ＳＭ９８ＤＲ１３ＣＶ７７７登录号ＦＪ４７３３９２ＡＹ６５３２０６ＤＱ０７２７２６ＪＮ５４７２２８ＡＢ６１８６１９ＧＵ９３７７９７ＪＱ０２３１６１ＡＦ３５３５１１３７３

／／／）在线软件对Ｎ蛋白ｔｒｅｄｉｃｔｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｗｗｗ．ｐ：ｐｐｇ进行功能位点分析；利用ＡｎｔｉｂｏｄＥｉｔｏｅＰｒｅｄｉｃ－　ｙｐｐ　（／／／／／ｔｉｏｎｈｔｔｏｏｌｓ．Ｉｍｍｕｎｅｅｉｔｏｅ．ｏｒｔｏｏｌｓｂｃｅｌｌｔｐ：ｐｐｇ

＿）进行Ｎ基因的Ｂ细胞抗原表位预测。ｉｅｄｂｉｎｕｔｐ／／／利用ＤＩＳＰＨＯＳ（ｈｔｔｄａｂｉ．ｔｅｍｌｅ．ｅｄｕｄｉｗｗｗ．－ｐ：ｐ／）对Ｎ蛋白磷酰化位点进行预测。ｓｈｏｓｐ

分离地及时间，２Ｃｈｉｎａ００６，２Ｃｈｉｎａ００４，２Ｃｈｉｎａ００３，１Ｃｈｉｎａ９８６，２Ｊａａｎ０１１ｐ，２Ｋｏｒｅａ０１０，２００９Ｋｏｒｅａ１Ｂｅｌｉｕｍ，９７７ｇ本实验室毒株用斜体表示　　注：

１．３７　ｐＥＴ２－－Ｎ重组质粒的构建及表达　使用引α

物Ｎ模板为１．Ｆ、ＮｂｄｂｄＣＲ扩增，５中的－－Ｒ进行Ｐ反转录产物，反应体系和反应条件与１．５一致。回收目的片段，连接至ｐ阳性重组质粒１８ＭＤ－Ｔ质粒，命名为ｐ１８ＭＤ－Ｔ－Ｎ。同时使用性内切酶

３ＥＴａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ对ｐ２１８ＭＤＢ－－Ｔ－α空质粒和ｐ

Ｎ重组质粒进行双酶切后回收ｐ３Ｔ２Ｅ－α空质粒中质

清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ＩＡＢ底物进行显色。Ｇ和Ｄｇ

９　间接ＥＬＩＳＡ方法的建立１．

ＬＩＳＡ最佳工作浓度的确定　采用方１．９．１　间接Ｅ阵滴定法确定Ｎ蛋白包被浓度和待检血清的稀释

度。用包被缓冲液将Ｎ蛋白稀释为９．０４、４．５２、

／ＬＩＳＡ反２．２６、１．１３、０．７５ｍＬ共５个梯度包被Ｅｇ

／孔；粒大片段和ｐ１８００μＬＰＥＤＶ阳性血清和阴性血清分别ＭＤ１－Ｔ－Ｎ重组质粒中Ｎ基因片段，应板，

然后使用ＴＮＡ连接酶于１６℃条件下连接过夜，作１∶５０、１∶１００、１∶２００和１∶３００共４个稀释度４Ｄ

阳性重组质进行间接Ｅ从而确定抗原和血清的最佳对重组质粒进行酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定，ＬＩＳＡ测定，粒命名为ｐ３Ｔ２Ｅ－－Ｎ。将重组质粒转化至宿主菌α

工作浓度。在确定Ｎ蛋白包被量和待检血清稀释倍数后，对二抗浓度进行摸索，分别对二抗作１∶１０００、１∶２０００、１∶３０００、１∶４０００共４个稀释度。　　　ＬＩＳＡ方１．９．２　临界值的确定　用已建立的间接Ｅ

法检测４为减小误０份背景清晰的ＰＥＤＶ阴性血清，差，重复２次，依据统计学原理，当Ｄ４ｘｓ时，珚＋３５０＞可以在９９．９％的水平上判定为阳性。

待菌液Ｄ６Ｌ２１中，．８左右时加入终浓度为Ｂ００值为０

／）在ａｏｌＬ的ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｒｏｌｔｈｉｏｌａｃｔｏｓｉｄｅ１ｍ－－Ｄ－ｇｐｐｙβ３７℃条件下进行诱导表达。取诱导后的菌液１ｍＬ

／于１加入细菌裂００００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ收集沉淀，　解液将沉淀混匀后使用超声波破碎菌体，破碎完全／后１００００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ后分别取上清和沉淀加　

，１．入适量的２×Ｓ取１ＤＳ凝胶上样缓冲液后沸水煮５ｍｉｎ０９．３　重复性试验　用同一批包被的酶标板，

／然后再８份血清，在其他条件不变的情况下，在不同时间应用Ｐ００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ后进行ＳＤＳＡＧＥ０－　电泳分析，检测目的蛋白的表达形式。另外，对最佳的诱导时间进行摸索，同时诱导６管含重组质粒的然后在诱导后每小时取出１管，进行ＳＬ２１菌，ＤＳＢ－ＰＡＧＥ电泳分析。定量及Ｗｂ８　目的蛋白纯化、ｅｓｔｅｒｎｌｏｔ分析　使１．－用ＮａｉｒｏｓｅＨｉｓ标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋－Ａ　ｇ白，并使用Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白质定量试剂盒对目的蛋白进行定量分析。然后将纯化的目的蛋白经ＳＤＳ－与ＰＰＡＧＥ电泳后转印到ＰＶＤＦ膜上，ＥＤ阳性鼠血

本方法进行检测，每份样品重复３次，测定批内重复性；用不同时间包被的酶标板，在其他条件不变的情况下，检测１每份血清重复３次，测定批间０份血清，重复性。

阳性血清作对照，ＥＤ阴、１．９．４　特异性试验　以Ｐ

使用建立的Ｅ猪繁殖与呼吸综合ＬＩＳＡ方法对猪瘟、征、猪圆环病毒病、猪传染性胃肠炎阳性血清进行检测，确定其特异性。

用建立２份血清样本，１．９．５　比较试验　随机取２

３７４

Ｊ　ＶＳ０１４年３月　第３４卷　第３期　Ｃｈｉｎ　ｅｔｃｉ　Ｍａｒ．２０１４　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　　中国兽医学报　２　１１株有１６个抗原表位（Ｖ７７７株在３７３～３７６及Ｃ

／／３７８～３９７位为２个抗原位点，ＺＹ１１在３７３～ＣＨ／／，另外ＣＨ３９８位为１个抗原位点）ＺＹ１１株和Ｖ７７７株在３７３～４２９位氨基酸处抗原性差异较大Ｃ

（）。图２

的间接ＥＬＩＳＡ方法和猪流行性腹泻抗体诊断试剂盒（深圳芬德生物技术有限公司）同时进行检测，比较２种检测方法的符合率。

ＬＩＳＡ的临床初步应用　采集河南省１．９．６　间接Ｅ

不同地市４其中母猪血清１家猪场３０８份血清样本，仔猪血清样本１使用建立的样本１９７份，１１份，统计阳性率。ＬＩＳＡ方法进行检测，Ｅ

２　结果

２．Ｐ１　ＲＴＣＲ扩增获得ＰＥＤＶＮ基因全长序列　－　

可在１对扩增产物进行１％琼脂糖凝胶电泳，５４ｂ５　ｐ）的位置出现目的条带（图１

／２　Ｎ蛋白糖基化位点及抗原表位的分析　ＣＨ２．

／编码１个由４ＺＹ１１株Ｎ基因全长为１２６ｂ４１３　ｐ，个氨基酸组成的蛋白。糖基化位点分析显示，／／而ＣＨＶ７７７株有６个糖基化位点，ＺＹ１１株有７Ｃ个（在１２３～１２６位氨基酸处多出１个糖基化位点；另外，ＦＳＱ）Ｖ７７７株２０２～２０５位的糖基化位点ＮＣ

／／而ＣＨ为ＮＱＳＮ，ＺＹ１１株的为ＮＱＳＫ。抗原表位／／分析显示，而ＣＨＶ７７７株有１７个抗原表位，ＺＹＣ

图１　ＰＥＤＶ　Ｎ基因的ＰＣＲ扩增结果　Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ

；ＣＲ扩增结果Ｍａｒｋｅｒ１．ＰＥＤＶ　Ｎ基因的Ｐ

／／图２　Ｎ蛋白抗原表位分析Ａ．ＣＨＺＹ１１株Ｎ蛋白抗原表位分析；Ｂ．ＰＥＤＶＣＶ７７７株Ｎ蛋白抗原表位分析　

２．３　Ｎ蛋白磷酰化位点分析　ＣＶ７７７株Ｎ蛋白丝磷酰化丝氨酸位点有８个，氨酸含量为３而４％，／／磷酰化丝ＺＹ１１株Ｎ蛋白丝氨酸含量为３６％，ＣＨ

／／且ＣＨ氨酸位点１１个，ＺＹ１１株有１个磷酰化苏／／氨酸位点。ＣＨＺＹ１１株在２５３位、２５５位、２６０位以及２６６位氨基酸比ＣＶ７７７株多４个磷酰化位点。４　基于ＰＥＤＶＮ基因核苷酸序列的遗传进化分２．　

／／析　基于ＣＨＺＹ１１株和１５株ＰＥＤＶ参考毒株Ｎ基因核苷酸序列的遗传进化分析显示，ＥＤＶ可以Ｐ／／。其中ＣＨ分为３个群（图３）ＺＹ１１株属于第３

群，同属该群的还有２００３—２０１１年６株中国其他地、／／区毒株（２２ＣＨＪ２０１０、ＪＳ００４ＨＮＨ０７、ＨｕＮ、Ｂ－－／／／）和２第ＣＨＳＨＨ０６、ＬＪＢ０３００９年韩国ＤＲ１３株；

２群包括２０１０年韩国ＳＭ９８株、２００６年中国ＬＺＣ株和１第１群包括１９７７年比利时ＣＶ７７７株；９８６—／／／／２０１１年４株中国株（Ｓ、ＣＨＩＭＴ０６、Ｐ５５、ＣＨＣＨ

／）和２５株。ＧＤＳ０９３Ｐ０１１年日本８－２．３５　表达用ＰＥＤＶＮ基因片段的扩增及ｐＴ２Ｅ－－　αＮ阳性重组质粒的鉴定　通过ＲＰＴ－ＣＲ方法扩增连接至ｐ３４４ｂＴ２Ｎ基因上６Ｅ－α原核表达质ｐ片段，粒。对重组质粒ｐ３Ｔ２Ｅ－－Ｎ进行双酶切鉴定和α双酶切时在５ＣＲ鉴定，００、６４４ｂＰ９　ｐ左右有２条

，表带，图４）ＣＲ鉴定时在６４４ｂＰｐ左右有１条带（明重组质粒构建成功。

Ｊ　ＶＳ０１４年３月　第３４卷　第３期　Ｃｈｉｎ　ｅｔｃｉ　Ｍａｒ．２０１４　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　　中国兽医学报　２　３７５

／／图３　ＰＥＤＶＣＨＺＹ１１株和参考毒株Ｎ基因核苷酸序列的遗传进化分析　

血清稀释倍数后对二抗浓度进行摸索，确定二抗的最佳稀释倍数为１∶２０００。　

低图５　重组质粒在ＢＬ２１菌中不同诱导时间的表达　Ｍ．

图４　重组质粒的酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定　Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ

；；空质粒的双酶切（重ＸｈｏⅠ）Ｍａｒｋｅｒ１．ａｍＨⅠ／Ｂ２．；组质粒的双酶切鉴定（重组质粒ＸｈｏⅠ）ＢａｍＨⅠ／３．的ＰＣＲ鉴定

；分子量蛋白Ｍ未经诱导的含空质粒Ｂａｒｋｅｒ１．Ｌ２１菌；诱导的含空质粒Ｂ未经诱导的含重组２．Ｌ２１菌；３．分别诱导１、质粒ＢＬ２１菌；４～９．２、３、４、５、６ｈ的含重组质粒ＢＬ２１菌

２．Ｐｂ６　表达产物ＳＤＳＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｌｏｔ分析　－－中，对重组表达质粒ｐ在Ｅ．ＢｃｏｌｉＬ２１（ＤＥ３）ＴＥ　－／３２ｏｌＬ的ＩＰＴＧ进行诱导表达，ＤＳＳ－Ｎ使用１ｍ－α

ＰｃＢＡＧＥ电泳分析显示重组质粒在Ｅ．ｏｌｉＬ２１中以　与融合蛋白形式表达，其相对分子质量约为４１３００，　预测大小相符。另外，对最佳诱导时间进行摸索，确。使用Ｎ图５）定最佳诱导时间为５ｈ（ａｉｒｏｓｅ－ＡｇＨｉｓ标签蛋白纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化，ＰＤＳＡＧＥ电泳显示纯化后目的蛋白呈现单一条Ｓ－带，说明纯化效果良好；所ｂｅｓｔｅｒｎｌｏｔ分析显示，Ｗ－表达的蛋白能与抗ＰＥＤＶ全病毒小鼠阳性血清反应，说明重组Ｎ蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达）并且具有生物学活性（图６

７　间接ＥＬＩＳＡ条件的优化　方阵滴定结果显２．

／孔，待检血清的示，当Ｎ蛋白的包被量为０．２２６μｇ阳性血清Ｄ４稀释倍数为１∶１００时，．０且５０值接近１／。在确定Ｎ蛋白包被量和待检表３）ＰＮ值最大（

低分图６　目的蛋白的表达、纯化及Ｗｅｓｔｅｒｎｌｏｔ分析　Ｍ．ｂ－；子量蛋白Ｍ未经诱导的含空质粒Ｂａｒｋｅｒ１．Ｌ２１菌；未经诱导的含重组质诱导的含空质粒Ｂ３．２．Ｌ２１菌；经镍柱粒Ｂ诱导的含重组质粒Ｂ５．Ｌ２１菌；４．Ｌ２１菌；纯化的Ｎ蛋白；未经纯化Ｎ蛋白的Ｗ６．ｂｅｓｔｅｒｎｌｏｔ分－析；纯化后Ｎ蛋白的Ｗ７．ｅｓｔｅｒｎｌｏｔ分析ｂ－２．８　间接ＥＬＩＳＡ判定标准的确定　依据统计学原

可以在９理，当Ｄ４ｘｓ时，９．９％的水平上判定珚＋３５０＞为阳性。计算４＝ｘ０份阴性血清Ｄ４珚）５０的平均值（）标准方差（阴、阳０ｓ＝０．．１４５４，０４３８。根据公式，　　

３７６

Ｊ　ＶＳ０１４年３月　第３４卷　第３期　Ｃｈｉｎ　ｅｔｃｉ　Ｍａｒ．２０１４　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　　中国兽医学报　２　表３　抗原包被浓度及抗体稀释度的确定

包被抗原量（／·孔－１）ｇμ０．９０４　

０．４５２　０．２２６　０．１１３　０．０７５　

１∶５０　１．９２１６　　１．８７５７　　１．７４２７　　１．６８８５　　１．５５５３　　

阳性血清稀释度１∶１００　１．３１７７　　１．２１９６　　１．０４７８　　０．９８５５　　０．９１７９　　

１∶２００　１．１７３３　　０．９０４７　　０．８９１６　　０．７９３９　　０．７０８４　　

１∶３０００．９７６９　　０．８４７６　　０．７８３２　　０．７１８７　　０．６８７３　　

１∶５０　０．１０５０　　０．１２０１　　０．１００１　　０．０９４１　　０．０９３０　　

阴性血清稀释度１∶１００　１１０．１０　　０．０８３２　　０．０７１０　　０．０７００　　９１０．０６　　

１∶２００　０．０６９０　　０．０６５５　　０．０６３７　　０．０７１４　　０．０６５０　　

１∶３０００．０５１３　０．０５４９　０．０６８９　０．０５２１　０．０６３０　

，性血清临界值＝ｘ得出临界值为０．ｓ２７６９。为珚＋３　判定结果方便，判为阳性，确定样本Ｄ４０．２８时，５０≥否则判为阴性。

在３个９　重复性试验　用同一批包被的酶标板，２．

不同时间检测１每份样品重复３次，结果０份血清，用３个批内重复试验变异系数的平均值为１．７２％；

／／基于Ｎ基因的遗传进化分析结果显示，ＺＹ１１ＣＨ

株与２２００９年韩国ＤＲ１３株、０１１中国株亲缘２００３－日本疫苗关系近，而与中国现用疫苗株ＣＶ７７７株、／不属于株８５株及欧洲Ｂ３Ｐｒ１８７株亲缘关系较远，－同一群。

对Ｎ蛋白的糖基化位点分析显示，Ｖ７７７株有Ｃ

／／而ＣＨ抗原表位ＺＹ１１株有７个；不同时间包被的酶标板检测同样的血清样品１０份，６个糖基化位点，

／／而ＣＨ分析显示，Ｖ７７７株有１７个抗原表位，ＺＹＣ重复检测３次，批间重复试验变异系数的平均值为试验结果表明所建立的间接Ｅ９１％，ＬＩＳＡ方法重２．

复性较好。

１０　特异性试验　只有ＰＥＤ阳性血清为阳性反２．应，而猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪传染性胃肠炎阳性血清均为阴性反应，表明建立的间接ＥＬＩＳＡ检测方法具有良好的特异性。

２．１１　比较试验结果　用建立的ＥＬＩＳＡ方法和猪流行性腹泻抗体诊断试剂盒２种方法同时检测２２份临床血清样品，结果２种方法均检测出在这些样本中有２０份为阳性，２份为阴性。结果表明所建立间接ＥＬＩＳＡ方法与商品化试剂盒的符合度为００％。１

２．１２　临床检测结果　根据试验确定的最佳工作条件，对采自河南省不同地区３母猪血清０８份猪血清（仔猪血清１进行Ｅ９７份、１１份）ＬＩＳＡ检测。结果母１

／，仔猪血清ＰＥＤＶ抗体阳性率为８４．２６％（１６６１９７）／）。猪血清阳性率为２７．９３％（３１１１１

原因在于Ｃ１１株有１６个抗原表位，Ｖ７７７株在３７３

／／而ＣＨ７６及３７８～３９７位为２个抗原位点，ＺＹ～３

／／表示ＣＨ１１株在３７３～３９８位为１个抗原位点，ＺＹ

１１株在该区域的抗原性增强。在２个大的抗原表位（上２个毒株基本一３４～２１９位以及２３５～２９１位）１致，而在３目前７３～４２９位氨基酸处二者差异较大，对于这些差异是否能引起蛋白功能的变化尚不清／／楚。磷酰化氨基酸位点分析显示，ＺＹ１１Ｎ蛋ＣＨ白含有１１个磷酰化丝氨酸位点，１个磷酰化苏氨酸位点，而Ｃ增Ｖ７７７只含有８个磷酰化丝氨酸位点，加的磷酰化氨基酸位点集中在２５３～２６６位氨基酸处。对同为冠状病毒的鸡传染性支气管炎病毒研究

１６］

，磷酰化的Ｎ蛋白结合病毒Ｒ发现［ＮＡ的亲和力

表示Ｎ蛋白的磷酰化对Ｎ蛋白高于非病毒ＲＮＡ，

与病毒ＲＮＡ的结合起决定作用。磷酰化氨基酸位点的增加能增强Ｎ蛋白对病毒Ｒ进ＮＡ的亲和力，而推测磷酰化位点的增多可能对病毒增殖能力的增强起一定作用。近年来ＰＥＤ疫情不断暴发且变异

］１１７９－，因此推测流行毒株的毒力有增毒株不断出现［

３　讨论

［５］

直至１成功将Ｐ９８８年Ｈｏｆｍａｎｎ等１ＥＤＶ适

强趋势，而Ｎ蛋白的变异可能对病毒毒力增强起促进作用。

自２中国大范围暴发腹泻疫情，并０１０年以来，

］０１２５，２－。因此，造成养殖业巨大的经济损失［对ＰＥＤ

应Ｖｅｒｏ细胞，ＥＤＶ抗体的检测技术才得以快速发Ｐ展。但是与其他冠状病毒相比，ＥＤＶ分离培养难Ｐ度仍然较大，这在一定程度上了对ＰＥＤＶ分子生物学的研究，而且大规模的临床调查也变得非常／困难。通过对２０１１年ＰＥＤＶ河南流行毒株ＣＨ

／ＺＹ１１株Ｎ基因的克隆和序列分析显示，Ｎ基因全／编码４长１２６ｂ４１个氨基酸组成的蛋白。ＣＨ３　ｐ，／ＺＹ１１株与ＰＥＤＶ参考株Ｎ基因核苷酸序列的同源性均在９未发现有碱基的缺失或插入。５％以上，

的防控迫在眉睫。由于ＰＥＤ与猪传染性胃肠炎在临床上难以区别，因此长期以来鉴别诊断一直依赖于传统的病毒分离和中和试验，近些年则越来越多成本的应用ＰＣＲ方法。但由于这些方法费时费力、高、不适于批量样品的检测，所以无法在临床上广泛应用。将全病毒作为包被抗原建立的ＥＬＩＳＡ方法因Ｐ纯化比较困难且存在潜在的散毒ＥＤＶ的培养、

Ｊ　ＶＳ０１４年３月　第３４卷　第３期　Ｃｈｉｎ　ｅｔｃｉ　Ｍａｒ．２０１４　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　　中国兽医学报　２　风险而受到很大。近年来，随着分子生物学的发展，使用原核和真核表达系统直接对目的蛋白进行表达则越来越方便可行；而在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统因具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等优点而备受研究人员的青睐。另外，与之配套的ｐ３Ｔ２Ｅ－α载体属于高水平表达目的基因的ｐＴ系列载体的一种，Ｅ而且为了便于目的蛋白的检测与纯化，该载体中还大大增强了载体设计有编码Ｈｉｓａ－Ｔｇ基因的序列，

的功能性和实用性。

本试验通过分子克隆的方法构建ｐ３Ｔ２Ｅ－－Ｎα重组表达质粒，中然将其转化至Ｅ．ＢｃｏｉｌＬ２１（ＤＥ３）　后使用ＩＰＰＴＧ进行诱导表达，ＤＳＡＧＥ分析显示Ｓ－表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在。通过优化表达条件，成功实现了ＰＥＤＶ　Ｎ蛋白的高效表达。从表达产量来看，完全可以满足建立ＥＬＩＳＡ诊断方法的需求。将目的蛋白在变性条件下使用Ｎａｉｒ－Ａ－ｇ然后再经过ｏｓｅＨｉｓ标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，　

复性处理获得具有活性的重组蛋白；将纯化后Ｎ蛋白进行ＳＰＤＳＡＧＥ分析后显示在４１３００处出现单－　一条带，未见杂带，说明对目的蛋白的纯化效果良好。另外，ｂｅｓｔｅｒｎｌｏｔ分析显示所表达的重组ＮＷ－蛋白能与抗Ｐ表明所ＥＤ全病毒小鼠阳性血清反应，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。

本试验以纯化的ＰＥＤＶ　Ｎ蛋白作为包被抗原建立了检测Ｐ最佳抗原ＥＤＶ抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法，／孔，待检血清最佳稀释倍数为包被浓度为０．２２６μｇ酶标二抗最佳稀释倍数为１∶２阳性标００，０００，１∶１　准定为待检血清Ｄ４０．２８。交叉试验和重复性试５０≥验结果表明该方法具有较强的特异性和可重复性。应用本试验建立的ＥＬＩＳＡ对３０８份临床待检血清／），进行检测，仔母猪血清阳性率为８４．２６％（１６６１９７／。母猪抗体阳性猪血清阳性率为２７．９３％（３１１１１）率普遍较高，除与近２年猪场对母猪普遍高密度免疫Ｐ更可能与近年来ＰＥＤ疫苗有关外，ＥＤ在猪群中持续暴发流行有关。而未经人工免疫和自然感染说明母猪的抗Ｎ仔猪的ＰＥＤＶ抗体水平普遍较低，

蛋白母源抗体不能够有效地传递给仔猪。由于本试验建立的ＥＬＩＳＡ方法测得的主要是抗Ｎ蛋白抗体，所以仔猪抗体阳性率低可能是因为母猪的抗体水平还没有高到足以充分传递给仔猪，也可能是抗Ｎ蛋白抗体作为母源抗体在传递给仔猪的过程中受到或破坏。大量母源抗体阴性仔猪处于易感状态，可能是猪场ＰＥＤ疫情不断的重要原因之一。在目前情况下，究竟母猪群平均抗体水平达到多高才能

够有效保护仔猪尚有待研究。

７３７

本试验建立的间接ＥＬＩＳＡ方法不能区分野毒感染和疫苗免疫产生的抗体，但是可以用于猪群疫苗正常免疫之后抗体水平高低的监测，也可以根据抗体水平离散度来判断猪群是否有野毒感染，这对于指导猪场制定合理的免疫程序及有效的防治措施具有重要意义。参考文献：

［］ｅｂｏｕｃｋＰ，ＰｅｎｓａｅｒｔＭ．Ｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｉｓ１　　　　　　Ｄｐｐｇ

，［］ｗｉｔｈａｎｅｗｏｒｃｉｎｅｅｎｔｅｒｉｃｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＣＶ７７７Ｊ．Ａｍ　　　　　ｐ：，（）２１９２３．ＪＶｅｔＲｅｓ１９８０，４１２２　　－［］，２ｒｉｔｃｈａｒｄＧＣ，ＰａｔｏｎＤＪＷｉｂｂｅｒｌｅＧ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｍｉｓ　Ｐ　　　　　－ｙ　

ｓｉｂｌｅａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓａｎｄｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｏｅａｉｎ　　　　　　ｇｐｐ［］，１８．６ＢｒｉｔａｉｎＪ．ＶｅｔＲｅｃ１９９９，１４４：６１６－　

［３］　ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ＯｋａｄａＫ，ＯｓｈｉｍａＫ．Ａｎｏｕｔｂｒｅａｋｏｆ　　　　　

ｓｗｉｎｅｄｉａｒｒｈｏｅａｏｆａｎｅｗｔｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｒｏｎａ　　　　　　　　－ｙｐ［］，ｖｌｉｒｕｓｉｋｅａｒｔｉｃｌｅｓｉｎＪａａｎＪ．ＪｎＪＶｅｔＳｃｉ１９８３，４５：－　　　　　　ｐｐｐ８８２９３２．－［］，４ＤＳ，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃａｒｋＳＪＫｉｍ　Ｈ　Ｋ，Ｓｏｎ－　　　　Ｐ　　ｇ　

ｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｔ　　　　　　ｐｙｇｙｐｐ［］ｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ（ＰＥＤＶ）ｆｉｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓｉｎＫｏｒｅａＪ．Ａｒｃｈ　　　　，（）：Ｖｉｒｏｌ２０１１，１５６４５７７８５．５－［］，５ｕｎＲ　Ｑ，ＣａｉＲＪＣｈｅｎＹ　Ｑ，ｅｔａｌ．Ｏｕｔｂｒｅａｋｏｆｏｒｃｉｎｅ　Ｓ　　　　　　　ｐ

，［］ｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｉｎｓｕｃｋｌｉｎｉｌｅｔｓＣｈｉｎａＪ．Ｅｍｅｒ　　　ｐｇｐｇｇ　：，（）１６１６３．１ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２０１２，１８１－　

［６］ｕｒａｎａｖｅａＳ，ＰｏｏｌｅｒｍＰ，ＬｅｒｔｗａｔｃｈａｒａｓａｒａｋｕｌＰ，ｅｔ　Ｐ　　　ｊｐ

ｉｋｅｓｔｒａｉｎｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉａｌ．Ｃｈｉｎｅｓｅｌ　　　　　　－－ｐｐ，，［］：ｕｓＴｈａｉｌａｎｄＪ．ＥｍｅｒＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２００９，１５（７）１１１２ｒ　－ｇ　１１１５．

［］７ｕａｒｔｅＭ，ＬａｕｄｅＨ．Ｓｅｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｓｉｋｅｒｏｔｅｉｎｏｆ　Ｄ　　　　　　　ｑｐｐ

［］，ｔｈｅｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｏｅａｖｉｒｕｓＪ．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ　　　　　　ｐｐ：（）１９５２００．１１１９９４，７５５－［８］ｔｉｅｒＡ，ＴｏｂｌｅｒＫ，ＢｒｉｄｅｎＡ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　Ｕ　　　　　ｇｇ

ｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｒｏｔｅｉｎｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉ　　　　　　　－ｐｐｐ［］，（）：ｒ１ｕｓＪ．ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ１９９５，１０２１３７４８．－　

［］，９ｂｅｒｉｎｋＨ　Ｆ，ＥｄｅｒｖｅｅｎＪＣａｌｌｅｂａｕｔＰ，ｅｔａｌ．ｃｈａｒａｃｔｅｒ－　Ｅ　　　　ｇ

ｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｏｔｅｉｎｓｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｚｏｏｔｉｃｄｉｉ　　　　　　　　－ｐｐｐ，］，ｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｓＣＶ７７７［Ｊ．ＡｍＪＶｅｔＲｅｓ１９８８，ａ　　　　　４９：１３２０３２４．１－［］１０ｏｃｈｅｒｈａｎｓＲ，ＢｒｉｄｅａＡ，ＡｃｋｅｒｍａｎｎＭ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍ－　Ｋ　　　　ｇ

ｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　　　　　　ｐｐｐ（［］，ＰＥＤＶ）ｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅＪ．ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ２００１，２３　　ｇｑ：（）１３７４４．１２－［］１１ｏｆｍａｎｎＭ，ＷｌｅｒＲ．Ｅｎｚｍｅｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔｌ　Ｈ　　　－ｙｙ

ａｓｓａｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａ　　　　　　ｙｐｐ　［］ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｓｗｉｎｅｓｅｒａＪ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉ－　　　　　，ｏ２ｌ１９９０，２１：２６３７３．－８３７

Ｊ　ＶＳ０１４年３月　第３４卷　第３期　Ｃｈｉｎ　ｅｔｃｉ　Ｍａｒ．２０１４　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　　中国兽医学报　２　ｅｎｃｅｏｆａｈｉｈｌｒｅｖａｌｅｎｔｉｓｏｌａｔｅｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍ－ｕ　　　　　　　ｇｙｐｐｐｑ　

［］，ｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｉｎＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＪ．ＪＶｉｒｏｌ２０１２，８６　　　　　　（）：１７９５５１．

［］１８ｈｅｎＦ，ＰａｎＹ，ＺｈａｎＸ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅ　Ｃ　　　　　－ｇｐｇ　

ｕｅｎｃｅｏｆａｖａｒｉａｎｔｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ　　　　　　　ｑｐｐ］，：ｓｔｒａｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ．ＪＶｉｒｏｌ２０１２，８６（２２）　　　　１２４４８．

［］，１９ａｒｋＳＪＫｉｍ　Ｈ　Ｋ，ＳｏｎＤＳ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅ　Ｐ　　　　　ｇｐｇ　

ｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆａＫｏｒｅａｎｖｉｒｕｌｅｎｔｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒ　　　　　　　－ｑｐｐ［］，ｈｅａｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓａｔｔｅｎｕａｔｅｄｃｏｕｎｔｅｒａｒｔＪ．ＪＶｉｒｏｌｒ　　　　　　ｐ（）：２０１２，８６１０９６４．５

［］２０ｉＺＬ，ＺｈｕＬ，ＭａＪＹ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ　Ｌ　　　　　　　－ｉｏｎａｎｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉｔ　　　　　　　－ｐｙｇｙｐｐ［］ａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ（ＰＥＤＶ）ｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓｉｎｓｏｕｔｈＣｈｉｎａＪ．　　　　　，（）：ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ２０１２，４５１１８１８５．１　－［］２１ｉＷ　Ｔ，ＬｉＨ，ＬｉｕＹＢ，ｅｔａｌ．Ｎｅｗｖａｒｉａｎｔｓｏｆｏｒｃｉｎｅ　Ｌ　　　　　　　　ｐ

，，］ｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓＣｈｉｎａ２０１１［Ｊ．ＥｍｅｒＩｎｆｅｃｔ　　ｐｇ　，（）：Ｄｉｓ２０１２，１８８３５０３５３．１１－］［葛俊伟，马广鹏，等．抗猪流行性腹泻病毒Ｎ２１　裴敦国，

］蛋白单克隆抗备及部分特性鉴定［东北农业Ｊ．（）：大学学报，２００８，３９７８４９．８－［］孙东波，陈建飞，等．猪流行性腹泻病毒Ｎ蛋１３　冯　力，

］白单克隆抗体的制备与鉴定［中国预防兽医学报，Ｊ．（）：２００８，３０３１９１９３．１－［］陈少莺，朱小丽，等．１４ＴＧＥＶ与ＰＥＤＶ核衣壳　王　劭，

］蛋白双价基因原核质粒的构建与表达［福建农业Ｊ．（）：学报，２５．０１１，２６１１－［］１５ｏｆｍａｎｎＭ，ＷｌｅｒＲ．Ｐｒｏａａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｏｆｏｒ　Ｈ　　　　　　　－ｙｐｇｐ

［］ｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅＪ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｃ　　　　　　　－ｐ，ｂ２ｉｏｌ１９８８，２６：２２３５２３９．－［］１６ｈｅｎＨ，ＧｉｌｌＡ，ＤｏｖｅＢＫ，ｅｔａｌ．Ｍａｓｓｓｅｃｔｒｏｓｃｏｉｃ　Ｃ　　　　　　ｐｐ

ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｒｏｎｃｈｉ　　　　　－ｉｓｖｉｒｕｓｎｕｃｌｅｏｒｏｔｅｉｎａｎｄｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｏｌｅｏｆｔ　　　　　　　　ｐｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｉｎＲＮＡｂｉｎｄｉｎｂｕｓｉｎｓｕｒｆａｃｅ　　　ｐｐｙｇｙｇ　　　，：ｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ［Ｊ］．ＪＶｉｒｏｌ２００５，７９（２）１６４１　　－ｐ１７９．１

［］，Ｘ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅ１７ｕｏＹ，ＺｈａｎＪＤｅｎ　　　　Ｌ　－ｐｇｇｇ　　

（上接３７０页）

［］２ｒａｋｏｗｋａＳ，ＥｌｌｉｓＪＡ，ＭｅｅｈａｎＢ，ｅｔａｌ．Ｖｉｒａｌｗａｓｔｉｎ　Ｋ　　　　　　ｇ

：ｓｎｄｒｏｍｅｏｆｓｗｉｎｅｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｏｓｔ－　　　　　ｙｐｐｐｗｍｕｌｔｉｓｓｔｅｍｉｃｗａｓｔｉｎｓｎｄｒｏｍｅｉｎｎｏｔｏｂｉｅａｎｉｎ－　　　ｙｇｙｇｇ　　ｔｉｃｓｗｉｎｅｂｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ２ａｎｄｏ　　　　　　ｐｙ　

］，：ｏｒｃｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓ［Ｊ．ＶｅｔＰａｔｈｏｌ２０００，３７（３）２５４　　－ｐｐ２６３．

［］黄骏明．近１３０年我国猪伪狂犬病研究进展　朱庆虎，

［］（）：中国畜禽传染病，Ｊ．１６９９６６５９１．－［］，Ｊｅｔａｌ．Ｐａｔｈｏｅｎｅｓｉｓｏｆ４ｌｌａｎＧ，ＭｃＮｅｉｌｌＦ，Ｃａｓｓｉｄ　　　Ａ　ｙｇｙ　　

：ｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｏｆｃｏｌｏｓ　　　　－ｐｐｔｆｏｅｔａｌｒｕｍｄｅｒｉｖｅｄｉｌｅｔｓａｎｄｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｉ　　　　　　ｐｐｇｐｇ　］，（）：ｍａｔｅｒｉａｌ［Ｊ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１９９５，４４１４９４．６　－［］５ｅｒｎａｎｄｅｚＭ，ＲｏｄｒｉｕｅｚＬＤ，ＥｓｔｅｖｅＳＴ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌ　Ｈ　　　　　　－ｇ

ｅｎｔｏｆｍｅｌｔｉｎｔｅｍｅｒａｔｕｒｅａｓｅｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠｏｍｂ　　　　－ｐｇｐ　ｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｕｌｔｉｌｅｘｅ　　　　　　－ｐｙｐｇｎｅｔｉｃａｌｌｍｏｄｉｆｉｅｄｏｒａｎｉｓｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎａｌＢｉｏ－　　　ｙｇ（）：ｈｅｍ，２００３，３２３２１６４７０．ｃ１－［］６ｏｈｉｋｕｍａｒＮ，ＷａｎＸ，ＧｒｉｆｆｉｔｈｓＭ　Ｗ．Ｒｅａｌｔｉｍｅｍｕｌ　Ｊ　　－－　ｙｇ　

ｉｌｅｘＳＹＢＲＧｒｅｅｎａｓｅｄＰＣＲａｓｓａｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｔｂ　　Ⅰ－　　　－ｐｙ　ｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｓｅｒｏｖａｒｓａｎｄＬｉｓｔｅｒｉａ　　　　　　］，：ｍｏｎｏｃｔｏｅｎｅｓ［Ｊ．ＪＦｏｏｄＰｒｏｔ２００３，６６（１１）２１４１－　　ｙｇ１４５．２

［］，７ＬＫ，ＭａｒｔｉｎＩＡｌｆａＭ，ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｌｅｘＰＣＲｆｏｒｔｈｅ　Ｎ　　　　　　　ｇｐ　

］ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｅｔｒａｃｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｅｓ［Ｊ．ＭｏｌＣｅｌｌ　　　　　ｙｇ，（）：Ｐｒｏｂｅｓ２００１，１５４２２０９１５．－［］８Ｘ，ＬｕＰ，ｅｔａｌ．ＲｅａｌｔｉｍｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｋｏｌＤＬ，Ｚｈａｎ　Ｓ　　　　　　　ｇ　

［］ｃｅｌｌｓＪ．ＰｒｏｃＮａｔｌＤＮＡ．ＲＮＡｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｉｎｌｉｖｉｎ　　　　ｙｇ　（）：ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９８，９５２０１１１５３８１５４３．　　－［］，９Ｑ，ＢａｌｌＳ．ＵｓｅｏｆａｎｏｖｅｌｒｅａｌｉｍｅｕａｎｔｉａｎＪＸｉａｎｔ　　　　　　　Ｐ　－－ｑｇ　

ａｔｉｖｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｔ　　　　　ｐｐｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｔｏｋｉｎｅｓｏｎｃｔｏｍｅｔｈｏｄｔｏｓｔｕｄ　　　　　　　－ｙｙｙ　］ｈｒｏｍｅＰ４５０ｍＲＮＡｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒ［Ｊ．ｃ　　　　　ｐ，（）：ＭｅｔａｂＤｉｓｏｓ２０００，２８６Ｄｒｕ７７０９１３．　－ｐｇ　

［］１０ａｋｅｍｕｒａＭ，ＦｕｉａｋｉＨ，ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｔ　Ｔ　　　　－ｊｇｙ

ａｎｄｔｈｅｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｅａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓｂｔｈｅｎｉ　　　　　　　ｑｐｙｇｐ　　

，ｃｕｒｖｅｓｉｎｌｉｈｔｃｃｌｅｒ［Ｊ］．ＲｉｎｓｈｏＢｏｒｉｍｅｌｔｉｎ　　　　ｇｙｙｇ　（）：２００４，５２２１６７７１．１－［］１１ａｎ　Ｗ，ＨａｍｉｌｔｏｎＴ，ＷｅｂｓｔｅｒＳＳ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｌｅｘｒｅ　Ｆ　　　　　－ｐ

ｌｉｍｅＳＹＢＲＧｒｅｅｎＣＲａｓｓａｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｅｔａｔ　　ⅠＰ　　　　－－ｙ　［］ａｃｃｌｉｎｅｅｆｆｌｕｘｅｎｅｓｏｆＧｒａｍ－ｅａｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａＪ．ｒｎ　　　　　ｙｇｇ，（）：ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｂｅｓ２００７，２１４２２４５５６．　　－［］卫秀余，金爱华，等．伪狂犬病弱毒株的分离１２　沈　强，

］鉴定及生物学特性的研究［中国兽医杂志，２Ｊ．０００，：（）２６９５８．－［］魏战勇，郭显坡，等．猪伪狂犬病毒Ｓ１３ＹＢＲ　李明凤，

］河ＧｒｅｅｎＣＲ方法检测方法的建立［Ｊ．Ⅰ实时定量Ｐ（）：南农业大学学报，２００９，４３３２８７０１．３－［］李明凤，王东方，等．猪圆环病毒２型Ｓ１４ＹＢＲ　贾艳艳，

］西ＧｒｅｅｎＣＲ检测方法的建立［Ｊ．Ⅰ实时荧光定量Ｐ（）：北农林科技大学学报，２００９，３７３８８２６．－