hVEGF165及hBMP-7双基因共表达腺相关病毒载体的构建及鉴定黄向辉1 时志斌1 王坤正1
党晓谦1 杨佩1 余鹏博2
【摘 要】 目的 通过引入内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES），构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒载体（adeno-associated virus，AAV），并对其进行鉴定。 方法 以AAV腺相关病毒包装系统（helper-free system）为基础，将真核表达质粒pIRES中的IRES片段定向克隆至腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS中，形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的重组骨架质粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR扩增hVEGF165和hBMP-7基因，先后亚克隆入重组腺相关病毒骨架质粒IRES序列上、下游的多克隆位点，获得重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。将其和包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293 细胞，包装重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7，同时包装含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的重组病毒rAAV-IRES-GFP作平行对照。荧光显微镜下监测病毒包装效率，收获重组病毒后感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度，并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。 结果 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7经双酶切鉴定正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV-293细胞72 h后，病毒包装效率达95%～100%，收获的重组病毒具有较高浓度及活性，感染AAV-HT1080效率达90%，荧光计数法测定病毒感染滴度达5.5 × 1011 vp/mL。提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因hVEGF165及hBMP-7片段，重组病毒包装成功。 结论 成功构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7，收获的病毒具有较高滴度，为今后利用腺相关病毒载体进行hVEGF165及hBMP-7双基因共表达影响骨修复的体外及体内研究提供实验基础。【关键词】 腺相关病毒载体 VEGF BMP 中图分类号： Q782 Q812
文献标志码：A
内部核糖体进入位点序列
CONSTRUCTION OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR CO-EXPRESSING hVEGF165 AND
1111121
hBMP-7 GENES/ HUANG Xianghui, SHI Zhibin, WANG Kunzheng, DANG Xiaoqian, YANG Pei, YU Pengbo. Department
of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of School of Medicine, Xi’an Jiaotong University, Xi’an Shaanxi, 710004, P.R.China;
2
Laboratory of Virology, Shaanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention. Corresponding author: SHI Zhibin, E-mail: Objective To construct the recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector co-expressing 【Abstract】jackky9999@sohu.com
hVEGF165 and hBMP-7 depending on internal ribosome entry site (IRES) sequence, to measure the virus titer and to verify the correct recombination. Methods The AAV helper-free system was used to generate the rAAV co-expressing hVEGF165 and hBMP-7 genes. The IRES sequence from the bicistronic eukaryotic expression plasmid pIRES was cut down and subcloned into the ITR/MCS containing vector pAAV-MCS to get pAAV-MCS A-IRES-MCS B, in which upstream MCS A and downstream MCS B was constructed. The hVEGF165 and hBMP-7 genes were amplified by PCR and inserted into MCS A and MCS B respectively. The recombinant expression plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 was co-transfected into AAV-293 cells with pHelper and pAAV-RC for packaging of recombinant AAV. The green fluorescent protein (GFP) labeled rAAV-IRES-GFP was simultaneously packaged by using the parallel plasmid pAAV-IRES-GFP. The efficiency of rAAV packaging was monitored under fluorescent microscope and recombinant viral particles were harvested from infected AAV-293 cells. The virus titer was measured through infecting AAV-HT1080 cells, and the recombinant rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 was verified by PCR of the exogenous interest genes of hVEGF165 and hBMP-7. Results The recombinant plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 was verified by double digestion. Using the AAV helper-free system, GFP expression could be observed under fluorescent microscope 72 hours after triple plasmid co-transfection and the system provided a high packing ratio of 95%-100%. The rAAV has a high purity and high titer of 5.5 × 1011vp/mL, and AAV-HT1080 cell could be infected at a ratio of 90%. The recombinant virus was confirmed by PCR of exogenous hBMP-7 and hVEGF165 genes. Conclusion Recombinant rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 was successfully constructed with a high virus titer, which may offer the basement 基金项目：国家自然科学基金资助项目（30600624）
2 陕西省疾病预防控制中心病毒室1西安交通大学第二附属医院骨一科710004）作者单位：（西安，；E-mail: jackky9999@sohu.com通讯作者：时志斌，主治医师，研究方向：股骨头坏死、关节外科，
·808·
Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, July 2008, Vol. 22, No.7of in vitro and in vivo experiments of hVEGF165 and hBMP-7 co-expressing for gene therapy of bone regeneration. Adeno-associated virus VEGF BMP Internal ribosome entry site【Key words】
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (30600624)
股骨头坏死至今发病机制不明，缺血性坏死区的血运重建和骨组织修复存在较大障碍。骨组织修复是包括数种细胞激活、迁移、增殖和分化的多阶段过程，其中VEGF和BMP均在此过程中发挥重要作用，两者具有协同效应，联合应用后可产生较单独应用更有效的骨形成及骨修复促进作用。在现有的基因转染方法中，腺相关病毒载体（adeno-associated virus，
AAV）因具有宿主范围广泛、转染效率高、表达时间长、相对安全性高等特点，而成为目前基因治疗研究的热点之一。我们的研究拟构建重组腺相关病毒双基因共表达载体rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES）-hBMP-7，为进一步体外及体内研究提供实验基础，并为AAV介导hVEGF165及hBMP-7双基因共表达治疗股骨头缺血性坏死提供新的思路和方法。1 材料与方法1.1
主要试剂及材料
Ecoli DH5α菌株由陕西省疾病预防控制中心保
存；重组hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165及重组hBMP-7基因的质粒pBluescript KS-hBMP-7由西安交通大学第二医院骨科构建；真核表达载体pIRES质粒由西安交通大学第一医院消化内科郝志明博士后馈赠。AAV三质粒共转染腺相关病毒包装系统helper-free system）、病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080（Stratagene公司，美国）；各种工具酶及DNA marker（Takara公司，日本）；质粒小量抽提试剂盒及大量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒（Qiagen公司，德国）；引物合成及测序由北京奥科生物公司完成；FBS、高糖DMEM培养基等细胞培养试剂（Gibco公司，美国）；真核细胞磷酸钙转染试剂盒Invitrogen公司，美国）。
1.2 方法1.2.1
含有IRES序列及上、下游多克隆位点腺相关
病毒骨架质粒的构建 扩增真核表达质粒pIRES，用分别位于IRES序列上、下游的EcoRⅠ位点和BamHⅠ位点进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收631 bp处IRES序列目的片段。扩增腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS，EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后，与胶回收的IRES片断连接，筛选阳性克隆，构建形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的腺相关病毒
骨架质粒，标记为pAAV-MCS A-IRES-MCS B，利于后期在IRES序列上、下游依次插入目的基因（图1）。
图1 重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7构建过程
Fig.1 Conceptual diagram of construction of pAAV-hVEGF165-IRES-
hBMP-7
1.2.2 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7的构建 ①IRES序列上游插入hVEGF165基因片段：根据Pubmed中公布的人VEGF165基因（NM-003376）设计上、下游引物，用以扩增hVEGF165 cDNA全长序列。上游引入ClaⅠ；下游引入EcoRⅠ酶切位点，序列如下：上游引物5'- CCATCGATATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3'，下游引物5'-CGGAATTCTCACCGCCTCGGCTTGTC-3'。以pUC18-hVEGF165质粒为模板，进行PCR扩增反应。胶回收hVEGF165 PCR产物进行ClaⅠ、EcoRⅠ双酶切，将具有黏性末端的酶切产物定向亚克隆进经相同双酶切的pAAV-MCS A-IRES-MCS B的MCS A 中，连接产物转化感受态DH5α，筛选性克隆，标记为pAAV-hVEGF165-IRES-MCS B。
②IRES序列下游插入hBMP-7基因：根据Pubmed中公布的人BMP-7基因（NM-001719）设计
（（中国修复重建外科杂志2008年7月第22卷第7期上、下游引物，用以扩增hBMP-7 cDNA全长序列。上游引入BamHⅠ，下游引入SalⅠ酶切位点，序列如下：上游引物5'-GGCCGGATCCATGCACGTGCGCT-CACTGCG-3'，下游引物5'-GGCCGTCGACCTAGTG-GCAGCCACAG-3'。以pBluescript KS-hBMP-7质粒为模板，进行PCR扩增反应。胶回收hBMP-7 PCR产物经BamHⅠ、SalⅠ双酶切后，定向亚克隆进pAAV-hVEGF165-IRES-MCS B的MCS B中，筛选阳性克隆，标记为pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。对重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7进行各酶切位点的组合酶切，进一步验证重组连接的成功及外源目的基因插入方向的正确性。
1.2.3 携带hVEGF165及hBMP-7双基因重组AAV的包装 大量提取重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7、包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper以及平行对照骨架质粒pAAV-IRES-hr绿色荧光蛋白green fluorescent protein，GFP），终产物用灭菌TE液溶解为1 μg/μL。AAV-293 细胞用含10%FBS的高糖
DMEM 培养液进行培养，
包装24 h前将细胞传代接种于直径为100 mm 的细胞培养皿。取重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper 各10 μL（10 μg），采用磷酸钙转染法三质粒共转染AAV-293细胞进行重组病毒包装（rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7包装组）；同时取平行对照骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP与pAAV-RC、
pHelper 三质粒共转染AAV-293细胞，
用来包装携带GFP标记基因的rAAV-GFP对照病毒（rAAV-IRES-GFP平行对照组）；并以10 μL TE液替代骨架质粒，其余转染条件不变作为阴性对照（阴性对照组）。转染孵育6 h后，更换含10%FBS高糖DMEM培养液，37℃、
5%CO2条件下继续培养72 h完成病毒包装。倒置显微镜下监测各组AAV-293细胞表型变化及细胞毒性反应，并分别于病毒包装24、48、72 h时于激发波长
510 nm处，
倒置荧光显微镜下观察rAAV-IRES-GFP平行对照组AAV-293细胞中GFP表达量，计数表达绿色荧光细胞比例，确定病毒包装效率。转染72 h病毒包装完成后，收获rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7包装组和rAAV-IRES-GFP平行对照组的AAV-293细胞以及培养上清液，将细胞悬液反复冻融4次，室温下离心半径10 cm，1 × 104 r/min离心10 min，收集上清。此上清分别含有rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7和rAAV-IRES-GFP病毒。利用rAAV能够抵抗氯仿的特性，根据文献[1]方法采用“氯仿处理-聚乙二醇/NaCl沉淀-氯仿抽提”3个步骤进行病毒的分离、浓缩和纯化。
·809·
1.2.4 重组腺相关病毒滴度检测 将AAV-HT1080细
胞以3 × 105/ 孔接种于6孔培养板，37℃培养过夜，细胞生长约50%～60%融合后，更换完全培养液。取稀释的rAAV-IRES-GFP病毒液，以DMEM培养液10倍比梯度稀释，分别感染各孔AAV-HT1080细胞，每稀释梯度设3个复孔，同时设无病毒感染为阴性对照孔。37℃孵育2 h，感染孵育期间每隔30 min轻柔涡旋培养板。继续培养48 h后荧光显微镜下观察各孔细胞GFP表达量。计数各孔荧光细胞数量n，取10 <
n < 100孔进行病毒感染滴度测算，则重组AAV 感染滴度（vp/mL） = n ×该孔病毒液稀释倍数。
1.2.5 重组病毒基因组外源DNA 鉴定 分别取稀释的重组rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7病毒液和rAAV-IRES-GFP病毒液，加入DNase和RNase至终浓度1 μg/mL，室温下消化30 min去除残存的DNA和RNA杂质，蛋白酶K消化30 min裂解重组病毒颗粒外壳。按病毒DNA抽提试剂盒方法抽提重组病毒DNA基因组，取1 μL获得的病毒DNA基因组溶液作为模板，分别以hVEGF165上、下游引物及hBMP-7上、下游引物进行PCR 扩增反应（反应条件同前），扩增产物凝胶电泳分析鉴定外源目的基因hVEGF165及hBMP-7的成功重组。
2 结果
2.1 含有IRES序列及上、下游多克隆位点腺相关病
毒骨架质粒的鉴定
利用分子克隆方法，成功将真核表达质粒pIRES中的IRES序列定向克隆至腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS中，形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B，
EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定结果正确图2）。
2.2 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7的鉴定
成功从pUC18-hVEGF165质粒和pBluescript KS-hBMP-7质粒中扩增出hVEGF165和hBMP-7基因，测序结果正确。成功将目的基因hVEGF165和hBMP-7分别插入pAAV-MCS A-IRES-MCS B中IRES序列上、下游的多克隆位点中。对重组质粒pAAV-VEGF165-IRES-hBMP-7进行各酶切位点的组合酶切，产物片断大小与预期完全一致（图3、4）。 2.3 重组腺相关病毒包装效率观察
倒置显微镜下监测AAV-293细胞表型变化可见：rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7包装组和rAAV-IRES-GFP平行对照组反应相似，培养液颜色变黄，细胞聚
（（·810·
Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, July 2008, Vol. 22, No.7图2 重组pAAV-MCS A-IRES-MCS B双酶切鉴定 1：100 bp DNA ladder 2：pIRES质粒EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切 3：重组质粒pAAV-MCS
重组pAAV-hVEGF165-IRES-MCS B
BamH Ⅰ双酶切 4：pAAV-MCS空质粒 EcoRⅠ单酶切 5：DNA marker Ⅲ 图3 A-IRES-MCS B EcoRⅠ、
双酶切鉴定 1：100 bp DNA ladder 2：VEGF165 PCR 3：重组质粒pAAV-VEGF165-IRES-MCS B ClaⅠ、EcoRⅠ双酶切 4：pAAV-MCS A-IRES-MCS B空质粒 EcoRⅠ单酶切 5：DNA marker Ⅲ 图4 重组pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7双酶切鉴定 1：DNA marker Ⅲ 2：hBMP-7 PCR 3：重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 BamHⅠ、SalⅠ双酶切（产生BMP-7片段1.3 kb） 4：重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 ClaⅠ、BamH Ⅰ双酶切（产生hVEGF165+IRES片段1.2 kb） 5：重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 ClaⅠ、SalⅠ双酶切（产生hVEGF165+IRES+hBMP-7片段2.5 kb） 6：重组质粒pAAV- VEGF165-IRES-hBMP-7 BamHⅠ单酶切 7：GeneRuler DNA ladder mix
Fig.2 Identification of the recombinant pAAV-MCS A-IRES-MCS B 1: 100 bp DNA ladder 2: pIRES double digested with EcoR I/BamHⅠ 3: Recom-binant pAAV-MCS A-IRES-MCS B double digested with EcoRⅠ/BamHⅠ 4: pAAV-MCS digested with EcoRⅠ 5: DNA marker Ⅲ Fig.3 Identifi-cation of the recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-MCS B 1: 100 bp DNA ladder 2: VEGF165 PCR 3: Recombinant pAAV-VEGF165-IRES-MCS B double digested with Cla I/EcoRⅠ 4: pAAV-MCS A-IRES-MCS B digested with EcoRⅠ 5: DNA marker Ⅲ Fig.4 Identification of the recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 1: DNA markerⅢ 2: hBMP-7 PCR 3: Recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 double digested with BamH I/Sal I (hBMP-7 1.3 kb) 4: Recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 double digested with Cla I/BamHⅠ(hVEGF165+IRES 1.2 kb) 5: Recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 double digested with ClaⅠ/SalⅠ(hVEGF165+IRES+hBMP-7 2.5 kb) 6: Recombinant pAAV-VEGF165-IRES-hBMP-7 digested with BamH Ⅰ 7: GeneRuler DNA ladder mix
集较多，部分细胞聚集漂浮于培养液中；阴性对照组培养液颜色较红，细胞聚集、漂浮现象不明显。倒置荧光显微镜下观察rAAV-IRES-GFP平行对照组腺相关病毒包装效率：转染24 h 后已有少量荧光细胞出现，随时间延长表达荧光细胞数增多，荧光逐渐增强；转染72 h 后观察表达绿色荧光细胞数比例可达95%～100%（图5）。结合重组病毒包装组AAV-293细胞表型变化及平行对照组GFP表达结果，说明利用AAV helper-free system三质粒共转染AAV 293细胞方法成功包装出重组腺相关病毒，IRES序列下游基因可在细胞内成功表达，病毒包装效率达95%以上。2.4 采用荧光计数法测定重组腺相关病毒感染滴度
病毒感染AAV-HT1080细胞48 h后倒置显微镜下观察可见细胞生长状态良好，无明显细胞毒性反应；荧光显微镜下观察可见AAV-HT1080细胞表达GFP标记，各孔细胞表达GFP量与病毒稀释梯度相关。采用荧光计数法测定病毒感染滴度为5.5 × 1011 vp/mL，重组病毒感染AAV-HT1080效率达90%（图6）。2.5 重组病毒外源DNA扩增鉴定结果
rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7重组病毒组可分别观察到约600 bp和1 300 bp大小的条带，分别与外源目的基因hVEGF165和hBMP-7 cDNA大小相符合；而空病毒rAAV-IRES-GFP对照组未扩增出目的条带（图7、8）。3
讨论
骨修复是一个受多种细胞因子共同调控的复杂过
程，其中VEGF和BMP均发挥重要作用并得到广泛研究。VEGF是最主要的血管生成因子之一，它主要作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞分裂增殖及血管形成。VEGF介导的血管发生与骨形成具有密切关系，VEGF能促进软骨内成骨及骨折愈合过程中的血管再生，对骨折和骨缺损的修复有重要作用[2]。VEGF在引导血管生成的同时还具有直接促进成骨作用。研究表明，VEGF不但能刺激内皮细胞分泌成骨性物质，而且具有成骨细胞及破骨细胞趋化作用，可直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分化、增殖而促进新骨形成及修复[3-4]。Orlandini等[5]在体外培养人成骨细胞时
中国修复重建外科杂志2008年7月第22卷第7期·811·
图5 转染72 h后重组腺相关病毒包装效率观察
a 510 nm处GFP表达量（倒置荧光显微镜× 30）
b 自然光源对照（倒置显微镜×
b 自然光源对照（倒
30） 图6 重组AAV感染HT1080细胞48 h后感染效率观察（× 30） a 510 nm处GFP表达量（倒置荧光显微镜× 30）
置显微镜× 30） 图7 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7重组病毒组外源基因VEGF165 PCR鉴定 1：100 bp DNA ladder 2：rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7包装组 VEGF165 PCR 3：rAAV-IRES-GFP平行对照组VEGF165 PCR 图8 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7重组病毒组外源基因hBMP-7 PCR鉴定 1：DNA marker Ⅲ 2：rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7包装组 hBMP-7 PCR 3：rAAV-IRES-GFP平行对照组hBMP-7 PCRFig.5 Packaging efficiency of recombinant AAV 72 hours post transfection GFP expression at 510 nm (Inverted fluorescence microscope × 30)
a The GFP expression at 510 nm (Inverted fluorescence microscope × 30)
a The
b White light source (Inverted microscope × 30) Fig.6 Infection efficiency of recombinant AAV for HT1080 cells 48 hours post infection
b White light source(Inverted microscope × 30) Fig.7 Identification of rAAV-
hVEGF165-IRES-hBMP-7 by PCR of VEGF165 1: 100 bp DNA ladder 2: PCR products of rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 genome 3: PCR products of rAAV-IRES-GFP genome Fig.8 Identification of rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 by PCR of hBMP-7 1: DNA markerⅢ 2: PCR products of rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 genome 3: PCR products of rAAV-IRES-GFP genome
加入VEGF，其表面VEGF受体表达增多，并诱导自身分化，提高成骨活性。邹平洲等[6]在兔桡骨骨缺损模型中应用VEGF后能加速移植异体骨的血管化和爬行替代，促进骨缺损修复。同时，更多研究表明成骨细胞在各种生长因子刺激下也能合成VEGF。Saadeh等[7]研究表明TGF-β可调节成骨细胞VEGF表达进而影响骨折愈合过程，在大鼠下颔骨骨折愈合过程中，
TGF-β与VEGF表达存在剂量依赖关系，两者表达时相和模式几乎相同；Deckers等[8-9]研究显示，BMP也可能主要通过诱导成骨细胞中VEGF-A mRNA 表达来促进成骨细胞转化及血管生成，BMP诱导的骨形成和血管生成可被VEGF-A抗体阻断，说明VEGF很可能是这些骨生长因子的中介因子，是血管生成与骨再
生协同作用的物质基础。BMP属于TGF-β超家族成员，有明确的诱导成骨作用，是目前已知的唯一具有异位成骨能力的细胞因子。BMP-7 的主要生物学作用就是诱导间质细胞分化为成骨细胞，通过膜内成骨和软骨内化骨两种方式诱导成骨，促进生成新生骨。重组人BMP-7 在体外和体内试验中均显示了高效的骨诱导活性，促进成骨细胞增殖和ALP的表达，加速实验动物骨缺损愈合及牵张成骨处新骨形成[10-11]，并能促进软骨细胞蛋白多糖表达和关节软骨缺损的修复[12]。最近研究显示，BMP主要通过提高成骨细胞中VEGF mRNA 的表达发挥诱导血管生成和诱导成骨作用，抑制VEGF则可阻碍BMP-2、FGF-2诱导的血管生成以及BMP-7诱导的原始成骨细胞分化和
·812·
Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, July 2008, Vol. 22, No.7BMP-4诱导的骨形成[8，13-15]，影响实验性小鼠股骨骨折愈合和胫骨皮质骨缺损的修复[16]。以上研究结果均提示VEGF和BMP等不同生长因子可能作用于骨形成的不同阶段并存在协同作用，由BMP引起成骨细胞分泌VEGF，使血管发生与骨形成成为相互关联、相互促进协调的过程。近年来很多学者开始利用两者进行协同治疗，Huang等[17]将BMP和VEGF两者复合于支架材料修复骨缺损，证实局部再生骨量明显多于单个生长因子治疗组；邹海波等[18]在兔骨缺损局部联合应用复合VEGF165和BMP-2质粒的工程骨，术后观察骨缺损局部的血液供应、骨痂量明显增多，正常骨与工程骨交界处新生骨小梁结构以及成骨细胞附着均多于对照组。
在基因治疗中，联合应用多个具有协同作用的治疗基因通常可产生较单基因更为理想的效果。但是以往进行多基因联合治疗的方法存在不同缺陷，利用携带不同基因的独立载体系统同时转染靶细胞的方法，虽然可自由调节各表达载体的比例，但各基因的总表达效率低下；而用传统方法构建的多启动子表达载体，因为每个治疗基因都需要一个包括启动子、终止子等表达元件在内的完整基因表达盒，使得载体过于庞大，操作困难；而将2个基因融合表达的策略可能因蛋白结构相互影响而导致功能丧失。利用IRES构建多基因共表达载体，则可大大提高转移及表达效率。IRES序列是来源于某些病毒和细胞mRNA 5'端的一段非翻译区，大小130～460 bp，可在上游启动子的控制下和与之相连的基因共同转录[19]。IRES的RNA三级结构能通过一些特定内部分子的相互作用精确与40S核糖体亚单位结合，以不依赖帽的方式启动远端的mRNA翻译，从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白[20]。IRES连接多基因进行共表达时，多个基因的mRNA在同一条转录子上，但转录后的翻译过程是独立的，上游基因以传统方式进行翻译，下游基因依靠IRES序列以不依赖帽的方式进行翻译，保证了2个基因的独立结构及功能。利用IRES代替内部启动子不但可使多基因共表达载体大大缩小，而且还克服了传统多基因表达载体中启动子之间的相互抑制现象。由于AAV的包装容量有限，一般不超过5 kb，因此利用IRES 序列构建双基因共表达结构对于AAV的包装尤为有利。通过在腺相关病毒骨架质粒pAAV MCS中插入IRES序列，形成含有上、下游2个多克隆位点的双顺反子表达结构，分别插入hVEGF165和hBMP-7序列后总长仅为2.5 kb，属于AAV有效包装容量之内。我们实验经鉴定证实外源目的基因hVEGF165和hBMP-7已成功包装入重组腺相关病毒并融合于
病毒基因组内，提示重组病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7包装成功，成功获得双基因共表达AAV载体。
选择安全有效的载体系统进行基因转移和正确表达也是基因治疗需要考虑的重要问题。近年来，AAV 载体因其无致病性、低免疫原性及宿主范围广等优点，正日益成为理想的病毒载体。腺相关病毒属微小病毒科，是一种复制缺陷型病毒，需要其他病毒的辅助才能进行有效复制，AAV载体不含有任何已知人类疾病的相关序列，对人类无致病性，因此是目前安全性最好的病毒载体之一[21]；腺相关病毒免疫原性极低，能够感染各种宿主细胞，包括分裂期和静止期的多种细胞，且能定点整合至宿主细胞基因组中，因此腺相关病毒能携带外源基因进入宿主细胞并长期表达[22]。我们的实验采用AAV helper-free system，并利用IRES序列成功构建了hVEGF165和hBMP-7双基因共表达重组
AAV载体，重组病毒感染滴度测量使用经过优化的滴度检测细胞AAV-HT1080，排除了因各种细胞易感性不同引起的差异，并排除了不含目的基因病毒空壳对结果的影响，使病毒滴度检测更加稳定可靠。经检测重组病毒滴度达5.5 × 1011 vp/mL，能够成功高效转染真核细胞，满足了基因治疗所需高滴度重组病毒载体的要求。载体中的标记基因GFP可以方便在病毒包装、纯化过程中设置平行对照监测病毒包装效率及感染效率，并有利于后期重组病毒感染宿主细胞后的定位跟踪观察。所构建的重组rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7为下一步体外及体内试验研究hVEGF165及hBMP-7双基因的协同作用奠定了实验基础，为股骨头缺血性坏死治疗提供了新的思路和方法。
4 参考文献
1 Wu XB, Dong XY, Wu ZJ, et al. A novel method for purification of recombinant adeno-associated virus vectors in large-scale. Chinese Sci-ence Bulletin, 2001, 46 (6): 485-489.
2 Carano RA, Filvaroff EH.Angiogenesis and bone repair. Drug Discov Today, 2003, 8 (21): 980-989.
3 Dai J, Rabie AB. VEGF: an essential mediator of both angiogenesis and endochondral ossification. J Dent Res, 2007, 86 (10): 937-950.4 Mayer H, Bertram H, Lindenmaier W, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF-A)expression in human mesenchyreal stem cells: autocrine and paracrine role on osteoblastic and endothelial differen-tiation. J Cell Biochem, 2005, 95 (4): 827-839.
5 Orlandini M, Spreafico A, Bardelli M, et al.Vascular endothelial growth factor-D activates VEGFR-3 expressed in osteoblasts inducing their differentiation.J Biol Chem, 2006, 281 (26): 17961-17967. 6 邹平洲, 曾炳芳, 张先龙.血管内皮细胞生长因子在异体皮质骨移植修复骨缺损中的作用.中国修复重建外科杂志, 2005, 19 (8): 593-596.7 Saadeh PB, Mjehrara BJ, Steinbrech DS, et al. Transforming growth factor-beta1 modulates the expression of vascular endothelial growth
中国修复重建外科杂志2008年7月第22卷第7期·813·
mation and healing by stem cell-expressed VEGF and bone morphoge-netic protein-4. J Clin Invest, 2002, 110 (6): 751-759.
16 Street J, Bao M, deGuzman L, et al. Vascular endothelial growth factor
stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover. Proc Nat Acad Sci USA, 2002, 99 (15): 9656-9661.
17 Huang YC, Kaigler D, Rice KG, et al.Combined angiogenic and osteo-genic factor delivery enhances bone marrow stromal cell-driven bone regeneration. J Bone Miner Res, 2005, 20 (5): 848-857.
18 邹海波, 周亚莉, 安洪, 等. 血管内皮细胞生长因子165及骨形态发生
蛋白2促进兔骨缺损部位再血管化的研究.中华创伤骨科杂志, 2007, 9 (2): 147-152.
19 Pisarev AV, Shirokikh NE, Hellen CU. Translation initiation by factor
independent binding of eukaryotic ribosomes to internal ribosomal entry sites. C R Biol, 2005, 328 (7): 589-605.
20 Jang SK. Internal initiation: IRES elements of picornaviruses and hepa-titis c virus. Virus Res, 2006, 119 (1): 2-15.
21 Grieger JC, Choi VW, Samulski RJ. Production and characterization of
adenoassociated viral vectors. Nat Protoc, 2006, 1 (3): 1412-1428.22 Buning H, BraunFalco M, Hallek M. Progress in the use of adeno-associated viral vectors for gene therapy. Cells Tissues Organs, 2004, 17 (4): 139-150.
（收稿：2007-12-24
修回：2008-02-26）
factor by osteoblasts. Am J Physil, 1999, 277 (4 Pt 1): C628-637.8 Deckers MM, Vanbezooijen RL, van der Horst G, et al. Bone morpho-genetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor A. Endocrinology, 2002, 143 (4): 1545-1553.
9 傅德皓, 杨述华, 杨操, 等. 骨形态发生蛋白-2促进胚胎成骨细胞血管皮内生长因子表达的剂量依赖性效应. 创伤外科杂志, 2006, 8 (6): 541-545.
10 White AP, Vaccaro AR, Hall JA, et al.Clinical applications of BMP-7/
OP-1 in fractures, nonunions and spinal fusion. Int Orthop, 2007, 31 (6): 735-741.
11 Hu J, Qi MC, Zou SJ, et al. Callus formation enhanced by BMP-7 ex
vivo gene therapy during distraction osteogenesis in rats. J Orthop Res, 2007, 25 (2): 241-251.
12 Stove J, Schneider WB, Scharf HP, et al. Bone morphogenetic protein
7 (bmp-7) stimulates proteoglycan synthesis in human osteoarthritic chondrocytes in vitro. Biomed Pharmacother, 2006, 60 (10): 639-643.13 Claffey KP, Abrams K, Shih SC, et al. Fibroblast growth factor 2 activa-tion of stromal cell vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis. Lab Invest, 2001, 81 (1): 61-75.
14 Yeh LC, Lee JC. Osteogenic protein-1 increases gene expression of vas-cular endothelial growth factor in primary cultures of fetal rat calvaria cells. Mol Cell Endocrinol, 1999, 153 (1-2): 113-124.
15 Peng H, Wright V, Usas A, et al. Synergistic enhancement of bone for-
（本文编辑：王雁）
•广告目次•
中国修复重建外科杂志……………………………………………………………………………………… 封二上海瑞邦生物材料有限公司 ……………………………………………………………………………… 插页1山西奥瑞生物材料有限公司 ……………………………………………………………………………… 插页2封三上海其胜生物制剂有限公司……………………………………………………………………………插页3、封底山东福瑞达医药集团公司 ………………………………………………………………………… 插页5、……………………………………………………………………………… 插页6北京大清生物技术有限公司
•读者•作者•编者•
关于图表的要求本刊对文稿中的表和图要求设计应科学、简洁。图表均分别按其出现先后次序连续编码，并冠以图（表）题。说明性的资料应置于图（表）下方注释中，并在注释中标明图表中使用的全部非公知公用的缩写及表中的统计学处理。均采用三线表，表内数据同一指标有效位数一致，均数及标准差小数点后保留位数一致。需附中英文图题、表题及图注、表注。黑白图片必须具有良好的清晰度及对比度，层次分明；彩色图片要求色彩鲜明，图像清晰，高与宽比例以5∶7为宜。若刊用人像，应征得本人书面同意，或遮盖其能辨认出系何人部分（眼睛）。大体标本照片在图内最好有尺度标记；组织学图片需注明染色方法和放大倍数。图片采用JPG格式，分辨率300 dpi，以附件形式上传；图片也可插入正文相应位置，与稿件同时上传。
本刊编辑部2008-06-20
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容