豆科植物根瘤菌分类研究进展

豆科植物根瘤菌分类研究进展

史晓霞,师尚礼,杨 晶,王正凤

(甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州 730070)

摘要:根瘤菌是一类与农业生产关系密切的细菌,与豆科植物共生具有很高的固氮效率。根瘤菌分类作为生物固氮和细菌分类两个领域的结合点,具有十分重要的意义。随着根瘤菌资源的不断发现和科学技术的不断发展,根瘤菌分类从以互接种族为依据的传统分类逐步过渡到了以系统发育关系为依据的现代系统分类,特别是近十几年来,生物技术应用于根瘤菌系统发育及其分类的研究进一步促进了根瘤菌资源的开发利用,使得根瘤菌的分类及其系统发育研究有了突破性进展。 关键词:根瘤菌;分类;研究进展

中图分类号:S144.3 文献标识码:A 文章编号:1009-5500(2006)01-0012-06 根瘤菌(rhizobia)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌,它可以侵染豆科植物根部形成根瘤,固定空气中的分子态氮形成氨,为植物提供氮素营养。据统计,全球每年生物固氮量达1.75@108t[1],为世界工业氮肥产量的4.37倍占生物固氮总量的65%

[2]

1 根瘤菌分类研究的历史

早在1838年,Bonssingablt根据他的田间试验结果指出,豆科植物的营养生理和禾本科植物不同,三叶草和豌豆都可以从空气中取得氮素营养。后来,Lachamann(1858)和BopoMC(1886)发现豆科植物根瘤中含有微生物,并且指出根瘤的形成是微生物侵入植物的结果。到1886年,德国植物化学家Hellrgel和Wilfarth等人在柏林一次科学大会上发表研究报告证明豆科植物根瘤是由细菌感染引起的,只有形成根瘤才能固定大气中的氮素。1888年,荷兰学者Beijer-inckMW用植物叶片汁加天门冬酰胺,蔗糖和明胶缓冲液配制的培养基,从豌豆根瘤中第一次成功分离到根瘤菌,并将其命名为Bacillusradicicda。一年后,波兰学者Prozmowski用根瘤菌纯培养物接种豆科植物,形成了根瘤,并将之改称为Bacteriumradicicola。18年,Frank建议将可在豆科植物根上结瘤的细菌属名改为根瘤菌属(Rhizobium),并一直沿用至今。当时,Frank以为感染所有豆科植物结瘤的都是同一种根瘤菌,并取名为豆类根瘤菌(Rhizobiumlegumino-sarum),它只包括了3种根瘤菌:豌豆根瘤菌,苜蓿根瘤菌和百脉根根瘤菌。但自1984年以后,随着根瘤菌寄主范围的不断扩大和分子生物学技术的不断应用,根瘤菌分类突飞猛进,新属新种不断建立。目前,已由原来的2属4种发展到了7属36种。。根瘤菌与豆科植物的共。在农业生产和固氮生态

生是生物固氮体系中作用最强的体系,所固定的氮约

[3~5]

体系中起着极其重要的作用[6]。根瘤菌分类体系是根瘤菌理论和应用研究的基础,它对于人们研究根瘤菌基本的生态过程,认识根瘤菌与生态系统之间的关系,根瘤菌与其他有关物种的亲缘关系及其自身的演化、系统发育过程,保证根瘤菌资源和生态系统的合理开发与持续利用等具有十分重要的意义。随着新的根瘤菌资源的不断发现和科学技术的发展,根瘤菌分类从以互接种族为依据的传统分类逐步过渡到了以系统发育关系为依据的现代系统分类。特别是近十几年来,现代分子生物学技术的迅速发展和广泛应用,使得根瘤菌的分类及其系统发育研究有了突破性进展。因此,通过对根瘤菌分类和自身进化过程的研究,为确定根瘤菌的系统分类地位提供了科学依据

[7]

。

收稿日期:2005-04-05;修回日期:2005-11-14

基金项目:科技部奶业专项/优质饲草高效生产关键技术

与产业化开发0(编号:2002BA518A03)

作者简介:史晓霞(1982-),女,陕西省华县人,在读硕士。

师尚礼为通讯作者。草原与草坪 2006年 第1期 总第114期13

2 根瘤菌分类系统的发展

2.1 根瘤菌的早期分类系统

根瘤菌的早期分类一直是以互接种族(cross-in-oculationgroup)为主要依据的

[8]

豌豆根瘤菌R.leguminasarum

根瘤菌属苜蓿根瘤菌R.meliloti

Rhizobium百脉根根瘤菌R.loti

根瘤菌科Rhizobiaceae

慢生大豆根瘤菌B.japonicum

慢生根瘤菌属Bradyrhizobium土壤杆菌属Agrobacterium叶瘤菌属Phyllobacterium图1 Jordan根瘤菌分类系统

Fig.1 JordanRhizobiumclassificationsystem

。1926年,Dangeard

根据宿主的种类和互接种族的关系,结合一些形态和生理性状,将根瘤菌分为若干种。1932年,Fred等人又在此基础上,首次提出了根瘤菌分类系统,他们根据互接种族的关系,将全部根瘤菌定义为1属5种。表1列出了这5个种以及每个种寄主植物的属名[9]。 19年,Craham用数值分类法,依据表型特征的差异,将根瘤菌分为两大类群,并建议将其定为两个属,但当时未被接受。直到1974年,在5伯杰细菌鉴定手册6(第八版)中,Jordan和Allen根据互接种族,生长速度及鞭毛类型将细菌分为两个相互区别的类群,并与土壤杆菌属一起构成根瘤菌科。

表1 根瘤菌分类系统

Table1 FredRhizobiumclassificationsystem种名

苜蓿根瘤菌(R.meliloti)三叶草根瘤(R.trifolii)

豌豆根瘤菌(R.leguminasarum)菜豆根瘤菌(R.phasoli)羽扇豆根瘤菌(R.lupini)

寄主植物的属名苜蓿属(Medicago)胡芦巴属(Trigonella)车轴草属(Trifolium)豌豆属(Pisum)野豌豆属(Vicia),香豌豆属(Lathyrus)兵豆属(Lens)

菜豆属(Phaseolus)羽扇豆属(Lupinus)

2.2 根瘤菌分类研究的现状

早期的根瘤菌分类系统以互接种族和寄主范围以及一些简单的形态和生理性状为依据,但对根瘤菌与其他菌的关系研究是零星的、不系统。随着原核生物分类技术的改进和根瘤菌研究工作的深入,对根瘤菌系统发育的研究也随着根瘤菌分类系统的不断补充与完善而得以系统化、科学化。其后又发现了许多新种,并确定了其分类地位,目前,根瘤菌科已发展到7属36种(表2)。

2.2.1 根瘤菌属(Rhizobium) 根瘤菌属是根瘤菌科中建立最早的一个属(Frank,18)。本属根瘤菌的重要特征是能侵入温带和某些热带的豆科植物的根毛,促使其形成根瘤,并在根瘤内成为细胞内共生体。所有菌株都表现出寄主特异性,而且根瘤菌在根瘤内能呈类菌体。该属的分类一直处于非常活跃的状态。目前共有12种,即:菜豆根瘤菌(R.etli),高卢根瘤菌(R.gallicum),海南根瘤菌(R.hainanense)[11],豌豆根瘤菌(R.leguminosarum),内蒙根瘤菌(R.mongo-lense),热带根瘤菌(R.tropici),山羊豆根瘤菌(R.galegae),贾氏根瘤菌(R.giardinii),胡特根瘤菌(R.huautlense),杨陵根瘤菌(R.yanglingense),木兰根瘤菌(R.indigoferae),黄土根瘤菌(R.loessense)[12]。模式种为豌豆根瘤菌。

2.2.2 中华根瘤菌属(Sinorhizobium) 1988年陈文新等[13,14]对快生大豆根瘤菌进行了系统研究,将其确定为一个的新属。该属细菌能结瘤固氮的寄主范围并不广泛,主要能在野生大豆和栽培大豆上结瘤[15]。目前该属有9个种,即:弗氏中华根瘤菌(S.fredii),苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)

[16~18]

随着研究工作的广泛深入和结瘤豆科植物的不断发现,互接种族的概念陷入了混乱,族间结瘤的报道剧增。例如,有些根瘤菌可以与不同的豆科植物共生结瘤,而有些根瘤菌则不能在其互接种族的全部宿主上结瘤;有些根瘤菌可以与非豆科植物结瘤,而有些根瘤菌却只能与某一品种或具有地区特异性的豆科植物结瘤。鉴于原有根瘤菌分类系统的不合理性,Jordan在1984年出版的5伯杰系统细菌学手册6(第一卷)中,总结了前人数值分类、DNA碱基组成、DNA同源性、血清血分析、胞外多糖成份分析、全细胞可溶性蛋白电泳和rRNA-DNA杂交等大量研究结果,对根瘤菌科分类系统进行了修订(图1)

[10]

,撒哈拉中

。

华根瘤菌(S.saheli),多宿中华根瘤菌(S.terangae),中华根瘤菌(S.ensis),鸡眼草中华根瘤菌(S.kummerowiae),莫雷兰中华根瘤菌(S.morelense),木本中华根瘤菌(S.arboris),柯斯梯中华根瘤 Jordan提出的分类系统是对根瘤菌分类工作的一个阶段性总结,由于他所研究的菌株覆盖面有限,还有许多菌株没能确定分类地位,所以该系统仍不完善。14GrasslandandTurf (Bimonthly) 2006 No.1 (Sum No.114)

表2 根瘤菌科最新分类系统

属名

根瘤菌属Rhizobium

种名菜豆根瘤菌R.etli高卢根瘤菌R.gallicum海南根瘤菌R.hainanense碗豆根瘤菌R.leguminosarum内蒙根瘤菌R.mongolense热带根瘤菌R.tropici山羊豆根瘤菌R.galegae贾氏根瘤菌R.giardinii胡特根瘤菌R.huautlense杨陵根瘤菌R.yanglingense黄土根瘤菌R.loessense木兰根瘤菌R.indigoferae

寄主植物菜豆Phaseolusvulgaris菜豆Phaseolusvulgaris

长波叶山蚂蝗Desmodiumsinuatum豌豆Pisumsatium花苜蓿Medicagoruthenica菜豆Phaseolusvulgaris山羊豆Galegaorientalis菜豆Phaseolusvulgaris山羊豆Galegaorientalis

山野豌豆Gueldenstaedtiamultiflora黄芪Astragalusspp.豌豆Pisumsatium大豆Glycinemax紫花苜蓿Medicagosativa鸡眼草Kummerowiastriata紫花苜蓿Medicagosativa大豆Glycinemax田菁Sesbaniapachycarpa阿拉伯胶树AcaciaSenegal阿拉伯胶树AcaciaSenegal阿拉伯胶树AcaciaSenegal百脉根Lotuscorniculatus紫云英Astragalussinicus鹰嘴豆Ciceraretinum鹰嘴豆Ciceraretinum

刺果甘草Glycyrrhizapallidiflora阿拉伯胶树Acaciasenegal紫穗槐Amorphafruticosa牧豆树Prosopisalba大豆Glycinemax大豆Glycinemax大豆Glycinemax胡枝子Lespedezabicolor长喙田菁Sesbaniarostrata假含羞草Neptunianatans猪屎豆Crotalariamucronata

中华根瘤菌属Sinorhizobium韦氏中华根瘤菌S.fredii莫雷兰中华根瘤菌S.morelense鸡眼草中华根瘤菌S.kummerowiae苜蓿中华根瘤菌S.meliloti中华根瘤菌S.gensis撒哈拉中华根瘤菌S.saheli多宿中华根瘤菌S.terangae木本中华根瘤菌S.arboris柯斯梯中华根瘤菌S.kostiense

中慢生根瘤菌属Mesorhizobium百脉根中慢生根瘤菌M.loti华癸中慢生根瘤菌M.huahuii鹰嘴豆中慢生根瘤菌M.ciceri

地中海中慢生根瘤菌M.meditertaneum天山中慢生根瘤菌M.tianshanense广布中慢生根瘤菌M.plurifarium紫穗槐中慢生根瘤菌M.amorphae查克中慢生根瘤菌M.chaconense

慢生根瘤菌属Bradyrhizobium埃尔坎慢生根瘤菌B.elkanii慢生型大豆根瘤菌B.japonicum辽宁慢生根瘤菌B.liaoningense圆明慢生根瘤菌B.yuanmingyuanense

固氮根瘤菌属Azorhizobium土壤杆菌属Agrobacterium叶瘤菌属Phyllobacterium

田菁固氮根瘤菌A.cuulinodans根癌土壤杆菌A.tumefaciens紫金牛叶瘤菌P.myrsinacearum

草原与草坪 2006年 第1期 总第114期

菌(S.kostiense),其中后5种为新近确定的。模式种为弗氏中华根瘤菌

[19]

15

myrsinacearum)。

。

2.2.3 慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium) Jordan将所有能够在大豆上有效结瘤的慢生型根瘤菌定名为慢生根瘤菌属(1982)。本属所有菌株都具有一定的寄主特异性,而且根瘤菌在根瘤内呈膨胀状(类菌体),可将大气中的氮固定成结合态的氮(铵),供寄主植物利用。此属具有遗传多样性,代表一个极其混杂的根瘤菌群。目前,已确定了4个种,即:埃尔坎慢生根瘤菌(B.el-kanii)

[20]

3 根瘤菌分类研究的方法

随着科学技术的不断进步,目前,细菌分类方法有了很大的发展。其主要研究方法有全细胞可溶性蛋白电泳

[23]

、多位点酶电泳、DNAG+C摩尔百分含量测

[26,27]

定、DNA-DNA杂交[24,25]、性片段长度多态性分析(RFLP)分析等

[28,29]

、随机扩增DNA片段多态性

(RAPD)、基因外回文重复序列PCR,16SrDNA序列

。

多相分类(polyphasictaxonomy)技术的应用使得根瘤菌的分类更加系统化、完整化,并且使得细胞分类及系统发育研究有了突破性进展。多相分类是将细菌的各种信息和数据综合起来,用于检验各种分类方法的一致性[30,31]。原则上讲,所有关于基因型的,表现型的以及系统发育的信息均属于多相分类的研究内容。目前,在根瘤菌的多相分类中,16SrDNA全系列分析和DNA-DNA相关性分析是必不可少的关键方法,对大量菌株进行初步分群的方法则有多种选择。 多相分类和系统发育研究被认为是现代细菌分类发展过程中的里程碑。在根瘤菌多相分类中使用各种不同的方法,目的是从多角度、多方位深入系统地认识根瘤菌的现象和实质。各种方法之间既有相似之处又各有其特点,因此,研究者要根据自己的目的和材料特点,选择合适的测定方法,促进根瘤菌分类不断发展。

,慢生型大豆根瘤菌(B.janonicum),辽宁慢

[15]

生根瘤菌(B.liaoningense),圆明慢生根瘤菌(B.yuanmingense)。其模式种为慢生型大豆根瘤菌

[

。

2.2.4 中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium) 早在1985年,陈文新等21]发现一群根瘤菌,生长速度中慢,介于根瘤菌属和慢生根瘤菌属之间,并成群,且经16SrRNA全系列分析后认为这一类群应列为一个新属)中慢生根瘤菌属。目前属内包括8个种,分别为:百脉根中慢生根瘤菌(M.loti),华癸中慢生根瘤菌(M.huakuii),鹰嘴豆中慢生根瘤菌(M.cicer),地中海中慢生根瘤菌(M.meditertaneum),天山中慢生根瘤菌(M.tianshanense),广布中慢生根瘤菌(M.pluri-farium),紫穗槐中慢生根瘤菌(M.amorphae),查克中慢生根瘤菌(M.chaconese)。其中后3个种为新近确定的。百脉根中慢生根瘤菌为模式种

[15]

。

2.2.5 固氮根瘤菌属(Azorhizobium) 固氮根瘤菌属是根瘤菌科非常独特的一个属。1988年,Dreyfus等人将一类分离自热带毛萼田菁(Sesbaniarostrata)上既能形成根瘤又能形成茎瘤,既能共生固氮又能自生固氮的根瘤菌确定为一个属:固氮根瘤菌属。只含一个种:田菁固氮根瘤菌(A.caulinodans)

[22]

4 讨论与建议

近年根瘤菌分类方法及分类系统研究上取得了长足的发展。早期的根瘤菌分类以互接种族关系为唯一依据,随着寄主范围的不断扩大和分子生物学技术的发展和应用,系统发育成为根瘤菌分类的核心部分,这种分类体系有助于人们理解根瘤菌自身的进化和发育过程以及根瘤菌和相关物种之间的亲缘关系。自从DeLey(1978)首次采用根瘤菌的系统分类学方法以来,随着新方法的不断引入,特别是根瘤菌多相分类技术的应用,根瘤菌的系统分类得到了迅猛发展,新的属、种不断被发现[4,7]。因此,从发展的观点出发,科技工作者应大力挖掘现有的根瘤菌资源,不间断的、经常性的进行根瘤菌资源的调查和筛选工作,以便筛选出更多高效固氮的根瘤菌。到目前为止,根瘤菌属已由1984年以前(Jordan)的2属4种发展到现在的7属36

。

2.2.6 土壤杆菌属(Agrobactreium) 土壤杆菌属是由康恩HJ于1942年建立的。本属多为植物致病菌,能够通过外伤侵入多种双子叶植物和裸子植物,致使植物细胞转化为异常增生的肿癌细胞,产生根癌和杆瘿等病状[19]。致病菌株主要存在于早先混杂有植物致病材料的土壤。该属模式种为根癌土壤杆菌(A.tu-mefaciens)[15]。

2.2.7 叶瘤菌属(Phyllobacterium) 叶瘤菌属是1984年克内泽尔DH发表的[7]。本属细菌在寄主植物体外呈直杆状,但在叶瘤中呈多形态,如杆状,椭圆形或分枝状。该属只有1个种:紫金牛叶瘤菌(P.16GrasslandandTurf (Bimonthly) 2006 No.1 (Sum No.114)

地位和进化本质能有更深入的认识。

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当前,苜蓿等豆科植物在我国西部地区的广泛种植已在建立可持续发展农业制度中起着不可替代的作用。我国豆科植物有1400多种。多年来,我国科学家以豆科植物根瘤菌为重点,逐步调查了我国豆科植物根瘤菌资源,进行了系统分类,发现了一些新属、种[33],并建立了我国最大的根瘤菌数据库,弥补了国际上对根瘤菌分类的不足,使其更加的系统化、完整化。

根瘤菌资源的开发利用目前在我国才刚刚起步,对根瘤菌资源的利用,总体来看还是极其有限的,只有少部分根瘤菌用于制造菌剂,推广利用于农业生产和科学研究工作[34]。因此,不仅需要长期有效地保护已有的菌种资源,深入研究各类菌种的特性,筛选各类寄主植物与根瘤菌种共生固氮的优良组合,而且要继续从不断变化着的自然界中分离筛选出新的根瘤菌种与寄主植物之间的优良组合,以不断满足共生固氮研究和根瘤菌接种剂生产对菌种资源的需要

[35]

。然而,目

前根瘤菌固氮效率的研究仅仅局限于根瘤菌与植物共生结瘤固氮的单个效应上,对根瘤菌与化学肥料,与其他促生菌、抑制菌等之间的协同作用、拮抗作用的研究不够深入,技术不够成熟,严重影响着根瘤菌的促生效果和推广应用[36,37]。因此,广泛开展根瘤菌资源调查,筛选和培育高效优良的固氮菌株(包括抗逆性菌株),扩大固氮资源应用范围和应用效果的研究,是目前根瘤菌研究的重点。

综上所述,随着根瘤菌资源的不断挖掘以及分子生物学技术的不断发展和人类对生命本质认识的深入,根瘤菌的分类也经历了很大的变化和发展。与此同时,随着根瘤菌新属、新种的不断产生,根瘤菌功能的开发,应用范围的扩大和遗传基础研究的深入,今后将会有更多、更简便、更准确的方法出现,不断充实和完善着根瘤菌分类系统,使人们对根瘤菌的系统发育草原与草坪 2006年 第1期 总第114期

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Researchadvancementintaxonomy

ofRhizobiumleguminosarum

SHIXiao-xia,SHIShang-li,YANGJing,WANGZheng-feng

(PrataculturalCollegeofGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

Abstract:Rhizobiumleguminosarumisakindofbacteriawhichisessentialtoagricultureproduction.Itissymbioticwithlegumeandhasexcellentefficiencytofixnitrogen.Beingthejointofbiologicalnitrogenfixationandbacteriaclassification,Rhizobiumtaxonomyisoneofthemostimportantfields.WiththefoundofnewRhi-zobiumresourcesanddevelopmentofscienceandtechnology,Rhizobiumtaxonomyhastransferfromtraditionclassificationtomodernsystematictaxonomy.Inthepastfewyears,somenewmolecularbiologicalmethodshavebeenappliedtotheRhizobiumtaxonomy,andthispromotetheutilizationofRhizobiumresources.Becauseofthesereasons,advancementhasbeenreachedinRhizobiumtaxonomyandsystematicresearch. Keywords:Rhizobium;taxonomy;advancement