(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108465058 A(43)申请公布日 2018.08.31
(21)申请号 201810468363.6(22)申请日 2018.05.16
(71)申请人 长春中医药大学
地址 130000 吉林春市净月开发区博
硕路1035号(72)发明人 邱智东 董雪莲 贾艾玲 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人 潘颖 赵青朵(51)Int.Cl.
A61K 36/88(2006.01)A61P 25/06(2006.01)
权利要求书1页 说明书30页 附图14页
()发明名称
一种治疗偏头痛的中药组合物及其制备方法和中药制剂(57)摘要
本发明涉及中药技术领域，特别涉及一种治疗偏头痛的中药组合物及其制备方法和中药制剂。以重量份计，该中药组合物由如下原料制成：
葛根1～99份，菊花1当归1～99份，川芎1～99份，
～99份，钩藤1～99份，天麻1～99份。本发明首次将本制剂处方配伍在一起，用于偏头痛的治疗。
CN 108465058 ACN 108465058 A
权 利 要 求 书
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1.一种中药组合物，其特征在于，以重量份计，由如下原料制成：当归1～99份，川芎1～99份，葛根1～99份，菊花1～99份，钩藤1～99份，天麻1～99份。2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，以重量份计，由如下原料制成：当归1～10份，川芎1～10份，葛根1～10份，菊花1～10份，钩藤1～10份，天麻1～10份。3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，以重量份计，由如下原料制成：当归3～5份，川芎2～5份，葛根2～5份，菊花3～5份，钩藤3～4份，天麻2～4份。4.权利要求1至3中任一项所述中药组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：回流提取：取葛根，加入乙醇水溶液回流提取，滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，得到第一浸膏和第一药渣；
煎煮提取：将所述第一药渣和当归、川芎、菊花、天麻，加入水煎煮1～4次，在最后一次煎煮结束前20～40min加入钩藤继续煎煮，滤过，合并滤液，浓缩，得到第二浸膏；
将第一浸膏和第二浸膏合并，干燥，得到中药组合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述回流提取步骤中，乙醇水溶液的体积百分含量为60％～90％，乙醇水溶液的加入量为葛根重量的4～10倍，回流提取的次数为1～4次，每次提取的时间为0.5～3h；浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述煎煮提取步骤中，水的加入量为第一药渣和当归、川芎、菊花、钩藤、天麻重量的4～10倍，每次提取的时间为0.5～3h；浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)。
7.权利要求1至3中任一项所述中药组合物在制备治疗偏头痛药物中的应用。8.一种中药制剂，其特征在于，包括权利要求1至3中任一项所述中药组合物和药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂或口服液。
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说 明 书
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一种治疗偏头痛的中药组合物及其制备方法和中药制剂
技术领域
[0001]本发明涉及中药技术领域，特别涉及一种治疗偏头痛的中药组合物及其制备方法和中药制剂。
背景技术
[0002]偏头痛自古至今都是困扰人们的疾病，在古代医学的记载中，偏头痛属的命名有很多种，均是以头痛为主要症状的一类病症。最常见的为“头痛”、“脑风”、“厥阴头痛”、“头风”等，最早在《阴阳十一脉灸经》中便有了对头痛的记载。偏头痛的中医病因根据其来源分为外感和内伤两大类，六淫邪气的侵袭是常见的外感原因，内伤则多与情志、饮食、先天禀赋等因素相关。其中偏头痛的病位在头部，与肝脾肾三个脏腑的关系十分密切，病症多属于本虚标实，其中标实指发作期，本虚多为缓解期。由于偏头痛病情十分复杂，病程缠绵，故在临床上虚实夹杂多常见。
[0003]在现有的流行病学调查结果中我们可以了解到，偏头痛在女性的发病率要远远高于男性，且在25-55岁时发病年龄最集中的年龄段。我国对偏头痛患者的治疗费用达到近900亿元。世界卫生组织发布的一项报告中，将常见疾病按照健康寿命损失年进行排序，偏头痛进了前20位。而严重的偏头痛被定义为类同于痴呆、四肢瘫痪和严重精神病的一种最致残的慢性疾病。同时研究者提出了多种关于偏头痛发病机制的学说，血管致病学说、神经致病学说、神经递质学说、三叉神经血管学说、线粒体机能异常说、镁缺乏说、基因变异说。[0004]随着科学的不断发展，人们对中药治疗偏头痛的接受度越来越高，临床上广泛应用传统医学疗法用来缓解偏头痛患者的疼痛症状，除汤剂外，还有应用了多种新型中成药制剂，除此以外还有针灸疗法、推拿疗法、穴位埋线治疗等。虽然在应用中得到了许多认可，但是对其疗效的机制研究却尚处于研究的初级阶段，各种疗法对偏头痛治疗的作用的机制研究需要进行更深一步的阐明。西药对偏头痛根据不同的作用机理有多种治疗药物，且药物价格低廉、作用靶点明确、安全性好，在临床中能够广泛使用。但是多种治疗偏头痛的药物对人的副作用较大，当长期或大量使用时会引起人的一系列的不适反应。我们作为新一代的中医，应该根据西医的利弊，充分发挥和利用中医和中药的优势，选择出疗效明确、毒副作用少且经济实用的中药复方，这具有十分重要的临床意义。综上所述，目前针对偏头痛的治疗药物品种繁杂，化学药物毒副作用较大，中药组方宽泛，药效成分不明确，且价格偏高。
发明内容
[0005]有鉴于此，本发明提供了一种治疗偏头痛的中药组合物及其制备方法和中药制剂。该中药处方具有治疗偏头痛的功效，安全有效，药物组成精致简练，主要成分清楚，药效明确，价格合理。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0007]本发明提供了一种中药组合物，以重量份计，由如下原料制成：
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说 明 书
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当归1～99份，川芎1～99份，葛根1～99份，菊花1～99份，钩藤1～99份，天麻1～99
份。
本研究旨在从本发明物对偏头痛治疗的作用机制方面进行研究，阐明药物的作用
机理。本发明处方是由当归、川芎、葛根、菊花、钩藤、天麻6味中药组成，方中主药川芎，辛温味薄气雄，功擅疏通，上行头目，下行血海，擅理气活血，搜风止痛。当归养血活血，功专通经止痛，辅川芎增强止痛之效，抑川芎辛窜太过之弊。二则吸前辈之诸华，贵川芎之量，有的放矢，前人以为川芎辛温香窜，不可过用，过用则伤津耗血，其实不然。顽症痼疾，不用足量，难以获效。清名医陈士铎之“散偏汤”足能证实。方中川芎达1两之多，实践证明并无伤津香窜之弊，然恰与当归性柔而润互为佐制，方中更有菊花，历三时之气，得天地之精，独秉金精，风木，故为祛风要药，主风头眩肿痛。天麻，得土之辛味，兼感天之阳气以生，入足厥阴经，凡头风眩晕，与夫痰热上壅，以致头痛及眩，所必需之药。钩藤禀春气以生，为手少阴足厥阴经要药，少阴主火，厥阴主风，风火相搏，则头痛而眩鸣，此药气味甘寒，直走二经，则风静火熄而痛止。葛根禀天地清阳发生之气，主邪热头痛，此君臣佐使配伍之妙也，诸药合用，同奏活血化瘀，通络祛风止痛之效。现代药理研究结果表明，本发明处方具有治疗偏头痛的功效。
[0010]同时，本发明产品具有药物组成精致简练，主要成分清楚，药效明确，价格合理的特点。
[0011]作为优选，以重量份计，由如下原料制成：[0012]当归1～10份，川芎1～10份，葛根1～10份，菊花1～10份，钩藤1～10份，天麻1～10份。
[0013]优选地，以重量份计，由如下原料制成：[0014]当归3～5份，川芎2～5份，葛根2～5份，菊花3～5份，钩藤3～4份，天麻2～4份。[0015]在本发明提供的一具体实施例中，以重量份计，由如下原料制成：[0016]当归3份，川芎5份，葛根5份，菊花5份，钩藤4份，天麻4份。[0017]在本发明提供的另一具体实施例中，以重量份计，由如下原料制成：[0018]当归3份，川芎4份，葛根2份，菊花3份，钩藤3份，天麻4份。[0019]在本发明提供的另一具体实施例中，以重量份计，由如下原料制成：[0020]当归5份，川芎5份，葛根3份，菊花4份，钩藤3份，天麻4份。[0021]在本发明提供的另一具体实施例中，以重量份计，由如下原料制成：[0022]当归3份，川芎5份，葛根3份，菊花4份，钩藤3份，天麻3份。[0023]在本发明提供的另一具体实施例中，以重量份计，由如下原料制成：[0024]当归5份，川芎2份，葛根3份，菊花3份，钩藤3份，天麻2份。[0025]本发明还提供了该中药组合物的制备方法，包括如下步骤：[0026]回流提取：取葛根，加入乙醇水溶液回流提取，滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，得到第一浸膏和第一药渣；[0027]煎煮提取：将第一药渣和当归、川芎、菊花、天麻，加入水煎煮1～4次，在最后一次煎煮结束前20～40min加入钩藤继续煎煮，滤过，合并滤液，浓缩，得到第二浸膏；[0028]将第一浸膏和第二浸膏合并，干燥，得到中药组合物。[0029]作为优选，回流提取步骤中，乙醇水溶液的体积百分含量为60％～90％，乙醇水溶
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[0009]
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液的加入量为葛根重量的4～10倍，回流提取的次数为1～4次，每次提取的时间为0.5～3h；浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)。[0030]优选的，回流提取步骤中，乙醇水溶液的体积百分含量为60％～80％，乙醇水溶液的加入量为葛根重量的4～10倍，回流提取的次数为1～3次，每次提取的时间为1.5～3h；浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)。[0031]优选的，回流提取步骤中，乙醇水溶液的体积百分含量为70％，乙醇水溶液的加入量为葛根重量的6倍，回流提取的次数为2次，每次提取的时间为1.5h；浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)。
[0032]作为优选，煎煮提取步骤中，水的加入量为第一药渣和当归、川芎、菊花、钩藤、天麻重量的4～10倍，每次提取的时间为0.5～3h；浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)。[0033]优选的，煎煮提取步骤中，水的加入量为第一药渣和当归、川芎、菊花、钩藤、天麻重量的4～10倍，每次提取的时间为1～2h；浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)。[0034]优选的，煎煮提取步骤中，水的加入量为第一药渣和当归、川芎、菊花、钩藤、天麻重量的6倍，每次提取的时间为1.5h；浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)。[0035]作为优选，煎煮提取步骤中，煎煮的次数为2～3次。[0036]优选的，煎煮提取步骤中，煎煮的次数为2次。
[0037]本发明还提供了该中药组合物在制备治疗偏头痛药物中的应用。[0038]本发明还提供了一种中药制剂，包括本发明中药组合物和药学上可接受的辅料。[0039]作为优选，中药制剂的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂或口服液。[0040]本发明提供了一种治疗偏头痛的中药组合物及其制备方法和中药制剂。以重量份计，该中药组合物由如下原料制成：当归1～99份，川芎1～99份，葛根1～99份，菊花1～99份，钩藤1～99份，天麻1～99份。本发明具有的技术效果为：[0041]本发明采用水煎、醇提等技术提取精制，使得提取物有效成分高，服用剂量小、药效成分明确的特点。
[0042]本发明首次将本制剂处方配伍在一起，用于偏头痛的治疗。实验结果表明，本发明专利低剂量组及高剂量组能够缩短甘油致偏头痛大鼠耳红消失时间，减少甘油致偏头痛大鼠挠头次数及爬杆次数，表明本发明专利具有缩短大鼠偏头痛发作时间及改善偏头痛状态作用。而对比制剂大鼠偏头痛发作时间及偏头痛状态无明显作用。附图说明
[0043]图1示本发明中药组合物及制剂的制备工艺流程；[0044]图2示各组大鼠脑组织HE染色光镜观察的结果；
[0045]图3示质谱数据的质控检验之鉴定肽段的质量误差分布；[0046]图4示质谱数据的质控检验之肽段长度分布；[0047]图5示鉴定蛋白质量与得分分布；[0048]图6示样品蛋白SDS-PAGE；[0049]图7示蛋白定量分布；
[0050]图8示上调蛋白(A)和下调蛋白(B)的GO富集结果(treat vs model)，横轴数值为显著p值(p<0.05)的负对数转换；
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图9示差异表达蛋白显著富集的某KEGG通路可视化展示(treat vs model)，图中
红色表示上调蛋白；亮绿色表示下调蛋白；黄色表示此节点中存在多个蛋白，其中包含上调及下调个体；
[0052]图10示上调蛋白(A)和下调蛋白(B)的KEGG通路富集图(treat vs model)，横轴数值为显著p值(p<0.05)的负对数转换；
[0053]图11示上调蛋白(A)和下调蛋白(B)的蛋白结构域富集图(treat vs model)，横轴数值为显著p值(p<0.05)的负对数转换；
[00]图12示差异蛋白根据倍数分为Q1-Q4的个数分布；[0055]图13示基于GO富集的聚类分析热图，包括生物过程(Biological Process)、细胞组成(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)等GO的三大类别；[0056]图14示基于KEGG通路和蛋白结构域富集的聚类分析热图；
[0057]图15示各组对模型大鼠中脑导水管周围灰质中c-fos阳性细胞灰度的影响；[0058]图16示各组对模型大鼠中脑导水管周围灰质中c-jun阳性细胞灰度的影响。具体实施方式
[0059]本发明公开了一种治疗偏头痛的中药组合物及其制备方法和中药制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0060]本发明药物组成：[0061]当归1～99份 川芎1～99份 葛根1～99份[0062]菊花1～99份 钩藤1～99份 天麻1～99份[0063]制备方法：以上6味，取葛根药材，加4～10倍量60～90％乙醇回流提取1～4次，每次0.5～3小时，滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)，备用；醇提后的药渣备用；
[00]药渣加入当归、川芎、菊花、天麻药材，加4～10倍量水煎煮1～4次，每次0.5～3小时(于结束前30分钟加入钩藤药材)，滤过，合并滤液，浓缩1.25～1.30(70℃)，与上述葛根醇提浸膏合并，干燥，粉碎成细粉。[0065]将上述提取物，加入0.1～10倍量辅料适量，制成各种口服剂型，即得。[0066]工艺流程图见图1。
[0067]本发明提供的一种治疗偏头痛的中药组合物及其制备方法和中药制剂中所用原料或辅料均可由市场购得。[0068]下面结合实施例，进一步阐述本发明：[0069]实施例1本发明物胶囊剂的制备[0070]以重量份计，本实施例原料包括：[0071]当归3份 川芎5份 葛根5份[0072]菊花5份 钩藤4份 天麻4份[0073]以上6味，取葛根药材，加6倍量70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并提
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取液，回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)，备用；醇提后的药渣备用；药渣加入当归、川芎、菊花、天麻药材，加6倍量水煎煮2次，每次1.5小时(于结束前30分钟加入钩藤药材)，滤过，合并滤液，浓缩1.25～1.30(70℃)，与上述葛根醇提浸膏合并，干燥，粉碎成细粉。
[0074]将上述提取物，加入2倍量淀粉混匀，制成胶囊剂型，即得。[0075]实施例2本发明物片剂的制备[0076]以重量份计，本实施例原料包括：[0077]当归3份 川芎4份 葛根2份[0078]菊花3份 钩藤3份 天麻4份[0079]以上6味，取葛根药材，加8倍量80％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)，备用；醇提后的药渣备用；药渣加入当归、川芎、菊花、天麻药材，加8倍量水煎煮2次，每次2小时(于结束前30分钟加入钩藤药材)，滤过，合并滤液，浓缩1.25～1.30(70℃)，与上述葛根醇提浸膏合并，干燥，粉碎成细粉。[0080]将上述提取物，加入2倍量淀粉混匀，制粒，压制成片，即得。[0081]实施例3本发明物颗粒剂的制备[0082]以重量份计，本实施例原料包括：[0083]当归5份 川芎5份 葛根3份[0084]菊花4份 钩藤3份 天麻4份[0085]以上6味，取葛根药材，加8倍量60～90％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)，备用；醇提后的药渣备用；药渣加入当归、川芎、菊花、天麻药材，加8倍量水煎煮3次，每次1小时(于结束前30分钟加入钩藤药材)，滤过，合并滤液，浓缩1.25～1.30(70℃)，与上述葛根醇提浸膏合并，干燥，粉碎成细粉。[0086]加入1倍量糊精，混匀，制成颗粒剂，即得。[0087]实施例4本发明物滴丸剂的制备[0088]以重量份计，本实施例原料包括：[00]当归3份 川芎5份 葛根3份[0090]菊花4份 钩藤3份 天麻3份[0091]以上6味，取葛根药材，加10倍量60％乙醇回流提取3次，每次3小时，滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)，备用；醇提后的药渣备用；药渣加入当归、川芎、菊花、天麻药材，加10倍量水煎煮3次，每次1小时(于结束前30分钟加入钩藤药材)，滤过，合并滤液，浓缩1.25～1.30(70℃)，与上述葛根醇提浸膏合并，干燥，粉碎成细粉。
[0092]将上述提取物，加入1.5倍量聚乙二醇加热热熔，混匀，滴制成丸，即得。[0093]实施例5本发明物口服液的制备[0094]以重量份计，本实施例原料包括：[0095]当归5份 川芎2份 葛根3份[0096]菊花3份 钩藤3份 天麻2份[0097]以上6味，取葛根药材，加4倍量80％乙醇回流提取1次，每次3小时，滤过，合并提取
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液，回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)，备用；醇提后的药渣备用；药渣加入当归、川芎、菊花、天麻药材，加4倍量水煎煮3次，每次1小时(于结束前30分钟加入钩藤药材)，滤过，合并滤液，浓缩1.25～1.30(70℃)，与上述葛根醇提浸膏合并，干燥，粉碎成细粉。[0098]将上述提取物，加入0.01倍量甜味素，加水溶化制成口服液，即得。[0099]对比例1[0100]组成：当归1000g、川芎500g、葛根333g。[0101]以上三味，川芎粉碎成粗粉与当归饮片置于CO2超临界提取萃取釜内进行萃取1小时，萃取温度60℃，萃取压力30MPa，提取物以8倍量β-CD应用研磨法(β-CD：水＝1：3)制成包合物，备用；超临界萃取后的当归、川芎药渣加6倍量80％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液回收乙醇，以转速8000转/分钟，离心20分钟，取离心液，浓缩，干燥，得提取物备用；葛根加8倍量80％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，回收乙醇，加水调整至药材浓度为0.5g/ml(即提取液上柱浓度)，提取液以AB-8型大孔树脂纯化，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，得提取物。将上述提取物与β-CD包合物混合，粉碎成细粉，加糊精适量，混合均匀，制成颗粒剂1000g，即得。[0102]试验例1
[0103]1材料与方法[0104]1.1动物
[0105]成年健康Wistar大鼠，实验室条件下饲养，雄性，体重220-260g，吉林大学实验动物中心提供，合格证号SCXK-(吉)2011-0003。[0106]1.2药品与试剂
[0107]琥珀酸舒马普坦片(海南先声药业有限公司)；对比例1制剂，本发明专利实施例1(长春中医药大学研发中心)；甘油注射液(北京益民药业有限公司)。[0108]1.3实验动物分组及偏头痛模型建立[0109]70只雄性Wistar大鼠随机分组：空白对照组(n＝10)、模型对照组(n＝10)、对比制剂低剂量组(n＝10)、对比制剂高剂量组(n＝10)、本发明专利低剂量组(n＝10)、本发明专利高剂量组(n＝10)及琥珀酸舒马普坦组(n＝10)。对比制剂低、高剂量组分别按剂量体重比1.8g/kg，3.6g/kg灌胃对比制剂溶液，本发明专利低、高剂量组分别按剂量体重比1.8g/kg，3.6g/kg灌胃本发明专利溶液；琥珀酸舒马普坦组按剂量体重比0.05g/kg灌胃琥珀酸舒马普坦片溶液，上述药物都用羧甲基纤维素钠溶液稀释，空白对照组及模型对照组灌胃等体积羧甲基纤维素钠溶液，各组均连续给药7天。末次给药30分钟后，除空白对照组，其余各组大鼠给予按剂量体重比10mg/kg臀部皮下注射甘油，空白对照组大鼠臀部皮下注射等体积生理盐水。潜伏期后5min内，观察大鼠行为学变化，以出现双耳发红，前肢频繁挠头，爬笼次数增多，咬尾，往返运动为造模成功的标准。[0110]1.4实验方法与观察指标
[0111]通过数码摄像机记录大鼠造模后行为表现，观察大鼠耳红，挠头及爬笼的行为。(1)耳红：记录大鼠造模后耳红出现及消失时间；(2)记录大鼠造模后挠头出现及消失时间，挠头的出现时间以大鼠连续挠头超过5次以上为记录标志，消失时间以大鼠在某一时间段中挠头次数小于5次为记录标志，并且伴随疲乏及倦怠表现；③挠头及爬笼次数：以30分钟作为一个时间段，分段记录大鼠造模后在各时间段挠头及爬笼次数。大鼠的挠头行为以前
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肢挠作为记录标志，爬笼行为以大鼠前肢抓笼盖作为记录标志[5]。[0112]1.5统计学分析
[0113]
采用SPSS 13.0统计软件，数据结果以均数±标准差表示，多组间均数比较
采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
[0114]2结果
[0115]2.1对比制剂与本发明专利对甘油致偏头痛大鼠耳红出现与消失时间的影响[0116]与模型对照组比较，本发明专利高剂量组大鼠耳红出现时间延后，本发明专利低剂量组及高剂量组大鼠耳红消失时间延长，差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。[0117]与模型对照组比较，对比制剂低剂量组及高剂量组对大鼠耳红出现及消失时间延长无明显影响，差异无统计学意义(p>0.05)。[0118]与模型对照组比较，舒马普坦组大鼠耳红出现时间延后，消失时间延长，差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。见表1。
[0119]表1对甘油致偏头痛大鼠耳红出现及消失时间的影响(n＝10)
[0120]
***
与模型组对照比较，P＜0.05，P＜0.01
[0122]2.2对甘油致偏头痛大鼠挠头次数的影响[0123]与模型对照组比较，本发明专利低剂量组及高剂量组大鼠在31-60min，61-90min，91-120min三个时间段内挠头次数减少，差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。[0124]与模型对照组比较，对比制剂低剂量组及高剂量组大鼠在各个时间段的挠头次数无明显变化，差异无统计学意义(p>0.05)。[0125]与模型对照组比较，舒马普坦组大鼠在31-60min，61-90min，91-120min三个时间段内挠头次数减少，差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。见表2。
[0121]
[0126]表2对甘油致偏头痛大鼠烧头次数的影响(n＝10)
9
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说 明 书
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[0128]
***
与模型组对照比较，P＜0.05，P＜0.01
[0130]2.3对比制剂对甘油致偏头痛大鼠不同时间爬笼次数的影响[0131]与模型对照组比较，本发明专利低剂量组大鼠在31-60min，61-90min两个时间段内爬笼次数减少,本发明专利高剂量组大鼠在31-60min，61-90min，91-120min三个时间段内爬笼次数减少，差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。
[0132]对比制剂低剂量组和高剂量组大鼠在各个时间段内爬笼次数无明显变化，差异无统计学意义(p>0.05)。
[0133]与模型对照组比较，舒马普坦组大鼠在31-60min，61-90min，91-120min三个时间段内爬笼次数减少，差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。见表3。[0134]表3对甘油致偏头痛大鼠不同时间爬笼次数的影响(n＝10)
[0129]
10
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说 明 书
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[0136]
***
与模型组对照比较，P＜0.05，P＜0.01
[0138]3小结
[0139]行为症状学评价为实验性偏头痛动物模型非常重要的观察指标，通过甘油诱导的偏头痛大鼠模型是诸多诱发偏头痛模型中较为常见的一种。观察偏头痛模型大鼠在单位时间段内耳红出现、消失时间、挠头及爬笼次数也是客观、量化的合理指标。[0140]本次实验，我们发现本发明专利低剂量组及高剂量组能够缩短甘油致偏头痛大鼠耳红消失时间，减少甘油致偏头痛大鼠挠头次数及爬杆次数，表明本发明专利具有缩短大鼠偏头痛发作时间及改善偏头痛状态作用。而对比制剂大鼠偏头痛发作时间及偏头痛状态无明显作用。
[0141]试验例2本发明物对治疗偏头痛初步药效学研究
[0142]实验一复方当归川葛颗粒对模型大鼠的行为学改变、脑组织及血浆中CGRP、β-EP的含量的影响
[0143]1.实验材料[0144]1.1实验动物
[0145]成年健康SD大鼠，雄性，共60只，体重220-260g，由吉林大学实验动物中心提供，动物许可证号为：SCXK-(吉)2011-0003。实验室饲养室温(24±1)℃，昼夜节律维持在照明12小时、黑暗12小时交替。所有大鼠在到达动物房后进行分笼，日常饮水和鼠粮均正常供应。实验人员在实验过程中时刻遵守《关于善待实验动物的指导性意见》。
[0137]
11
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1.2实验试剂
[0148]
[0149]
1.3实验器材
[0150]
2实验方法
[0152]2.1实验分组及流程
[0153]60只雄性SD大鼠随机分为6组：空白对照组、模型对照组、本发明物实施例3低剂量组、本发明物实施例3中剂量组、本发明物实施例3高剂量组及琥珀酸舒马普坦组。[01]本发明物低、中、高剂量组分别按剂量体重比0.9g/kg，1.8g/kg，3.6g/kg灌胃本发明物溶液，琥珀酸舒马普坦组按剂量体重比0.05g/kg灌胃琥珀酸舒马普坦片溶液，上述药物都用羧甲基纤维素钠溶液稀释，空白对照组及模型对照组灌胃等体积羧甲基纤维素钠溶
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[0151]
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液，各组均连续给药7天。在最后一次灌胃给药后半个小时进行造模，造模成功后进行行为学观察，抽血测定血浆内CGRP、β-EP的含量，最后对大鼠大脑组织进行处理，测定脑组织内CGRP、β-EP的含量。
[0155]2.2模型制备方法[0156]末次给药30分钟后，除空白对照组，其余各组大鼠给予按剂量体重比10mg/kg臀部皮下注射甘油，空白对照组大鼠臀部皮下注射等体积生理盐水。潜伏期后5min内，观察大鼠行为学变化，以出现双耳发红，前肢频繁挠头，爬笼次数增多，咬尾，往返运动为造模成功的标准。
[0157]2.3观察指标及方法[0158]2.3.1行为学观察
[0159]通过数码摄像机对大鼠造模后的行为表现进行记录，观察大鼠耳红出现时间及消失时间、挠头次数及爬笼次数等行为学变化。[0160](1)耳红：通过观察大鼠耳红出现和耳红消失的时间进行记录。[0161](2)挠头次数：对造模后大鼠进行为期3个小时的观察，以半个小时为时间节点，记录半个小时内大鼠挠头次数，大鼠的挠头行为记录标志为前肢挠头。[0162](3)爬笼次数：对造模后大鼠进行为期3个小时的观察，以半个小时为时间节点，记录半个小时内大鼠爬笼次数，爬笼行为的记录标志为大鼠前肢抓笼盖。[0163]2.3.2取材与处理[01]行为学记录结束后，采集腹主动脉血3ml放置在试管中，试管中预先加入45μl的10％EDTA二钠、60μl的抑肽酶，立即低温离心10min，分离出血浆后分装，放置在-20℃冰箱中保存。各组大鼠取脑，分离脑干，称重，操作全程在冰上操作，速度要快。组织放在生理盐水中，煮沸10min，充分灭活酶，能够保持神经肽的稳定性。随后迅速冷却，加入1N的HAC 1mL，放入玻璃匀浆器中进行匀浆操作，随后在4℃中放置1小时，加入1mL的1N NaOH来中和酸，使用低温离心机设定3000rpm/min离心15min，离心操作后取上清，在-20℃中保存待测。按照降钙素基因相关肽(CGRP)放射免疫试剂盒寿命数及β-内啡肽(β-EP)放射免疫试剂盒说明书测定各组大鼠大脑血浆及组织匀浆中CGRP及β-EP含量。[0165]CGRP及β-EP含量测定：按照放免试剂盒的说明，取出保存在-20℃的血浆及脑组织上清液复温，用离心机离心5min，取上清0.5ml加入到1ml酸性无水乙醇中，震荡混匀1min，再次离心15min，转速调制3500rpm。将离心好的上清液放到装有青霉素的瓶中，在水浴锅上蒸干，温度为45℃，时间为24h，待样品完全干燥后，加盖密封，放置到-20℃的冰箱中保存。使用时取出样品加入PBS 0.5ml混匀，再次放置到-20℃冰箱储存，待样品完全冰冻后取出，大约为4h。取出冰冻样品后放置到4℃冰箱内待完全融化，抽取200μl的上清液，按照说明书要求进行加液操作，用智能放免测量仪读取CGRP及β-EP浓度。[0166]另取大鼠脑组织，浸入4％多聚甲醛里定，再脱水、浸蜡、石蜡包埋制备石蜡切片，依次经过二甲苯脱蜡，降梯度酒精水化，苏木素及伊红染色，升梯度酒精脱水，二甲苯透明以及中性树胶封片等操作，制HE染色大鼠脑组织的切片，在光学显微镜下观测大鼠脑组织病理改变。
[0167]2.4统计学方法
[0168]
采用SPSS 19.0统计软件，数据结果以均数±标准差
13
表示，若方差齐性检验
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中方差齐，则多组间均数比较采用方差分析，若方差不齐，采用DunnettT3法。进一步两两比较采用样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。[0169]3结果
[0170]3.1本发明物对模型大鼠耳红出现与消失时间的影响
[0171][0172]
表4本发明物对模型大鼠耳红出现及消失时间的影响(n＝10)
组别剂量(g/kg)耳红出现时间(min)耳红消失时间(min)空白对照组-0±00±0模型对照组-3.17±0.81174.51±18.59本发明物低剂量组0.93.59±0.76168.49±21.13本发明物中剂量组1.84.17±0.74160.74±19.56*本发明物高剂量组3..57±0.69*148.07±18.49**舒马普坦组0.0.69±0.76*144.67±20.14**
***[0173]与模型对照组比较，P＜0.05，P＜0.01。
[0174]本发明物低剂量治疗组及本发明物中剂量治疗组的大鼠耳红出现时间较模型对照组有所延后，但差异并没有统计学意义。本发明物高剂量治疗组与舒马普坦治疗组的耳红出现时间与模型对照组相比有所升高，有统计学差异(P＜0.05)。耳红消失时间的比较中，本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比有所下降，但没有统计学差异。本发明物中剂量治疗组与模型组相比耳红消失时间更短，有统计学差异(P＜0.05)。本发明物高剂量治疗组与舒马普坦治疗组的耳红消失时间与模型对照组相比降低明显，有明显的统计学差异(P＜0.01)。
[0175]3.2本发明物对模型大鼠挠头次数的影响[0176]表5本发明物对模型大鼠挠头次数的影响(n＝10)
[0177]
***
与模型对照组比较，P＜0.05，P＜0.01。
[0179]与模型对照组相比，本发明物中剂量治疗组在31-60min，61-90min两个时间段内挠头次数减少，有统计学意义(P<0.05)，其他四个时间段也减少，但没有统计学差异。高剂量治疗组和舒马普坦治疗组与模型对照组相比，在31-60min，91-120min两个时间段内挠头次数减少，有统计学差异(P<0.05)，在61-90min时间段挠头次数减少明显，有明显的统计学
[0178]
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差异(P<0.01)，在其他三个时间段也有减少。
[0180]3.3本发明物对模型大鼠不同时间爬笼次数的影响[0181]表6本发明物对模型大鼠不同时间爬笼次数的影响(
[0182]
n＝10)
***
与模型对照组比较，P＜0.05，P＜0.01
[0184]与模型对照组相比，本发明物中剂量治疗组在31-60min，61-90min两个时间段内爬笼次数减少，有统计学意义(P<0.05)，其他四个时间段也减少，但没有统计学差异。本发明物高剂量治疗组和舒马普坦治疗组与模型对照组相比，在31-60min，61-90min两个时间段内挠头次数明显减少，有明显的统计学差异(P<0.01)，在91-120min时间段挠头次数减少，有的统计学差异(P<0.05)，在其他三个时间段也有减少，但没有统计学差异。[0185]3.4本发明物对模型大鼠血浆CGRP含量的影响
[0183]
[0186][0187]
表7本发明物对模型大鼠血浆CGRP含量的影响(n＝10)
组别剂量(g·kg-1)动物数(n)CGRP含量(pg/g)空白对照组-1042.16±5.16模型对照组-1085.06±9.14###本发明物低剂量组0.91074.14±7.41本发明物中剂量组1.81063.95±6.94*本发明物高剂量组3.610.16±8.05**舒马普坦组0.051050.09±6.19**
###***[0188]模型对照组与空白对照组比较，P＜0.001，与模型对照组比较，P＜0.05，P＜
0.01。
[01]模型对照组与空白对照组相比，血浆内的CGRP含量上升趋势明显，有明显的统计学差异(P<0.001)。本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比含量有所下降，但没有统计学差异。本发明物中剂量治疗组与模型对照组相比含量下降，有统计学差异(P<0.05)。本发明物高剂量治疗组和舒马普坦治疗组与模型对照组相比含量下降明显，有较明显的统计学差异(P<0.01)。
[0190]3.5本发明物对模型大鼠血浆β-EP含量的影响
[0191]
表8本发明物对模型大鼠血浆β-EP含量的影响(n＝10)
15
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[0193]
[0194]
###***
模型对照组与空白对照组比较，P＜0.001，与模型对照组比较，P＜0.05，P＜
0.01。
模型对照组与空白对照组相比，血浆内的β-EP含量下降趋势明显，有明显的统计
学差异(P<0.001)。本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比含量有所上升，但没有统计学差异。本发明物中剂量治疗组与模型对照组相比含量上升，有统计学差异(P<0.05)。本发明物高剂量治疗组和舒马普坦治疗组与模型对照组相比含量升高明显，有较明显的统计学差异(P<0.01)。
[0196]3.5本发明物对模型大鼠脑组织CGRP含量的影响
[0197][0198][0195]
表9本发明物对模型大鼠脑组织CGRP含量的影响(n＝10)
组别剂量(g·kg-1)动物数(n)CGRP含量(pg/g)空白对照组-10468.23±68.47模型对照组-106.45±91.24###本发明物低剂量组0.910605.84±84.71本发明物中剂量组1.810573.49±96.47*本发明物高剂量组3.6108.63±80.**舒马普坦组0.0510508.26±67.91**
###***[0199]模型对照组与空白对照组比较，P＜0.001，与模型对照组比较，P＜0.05，P＜
0.01。
[0200]模型对照组与空白对照组相比，脑组织内的CGRP含量上升趋势明显，有明显的统计学差异(P<0.001)。本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比含量有所下降，但没有统计学差异。本发明物中剂量治疗组与模型对照组相比含量下降，有统计学差异(P<0.05)。本发明物高剂量治疗组和舒马普坦治疗组与模型对照组相比含量下降明显，有较明显的统计学差异(P<0.01)。
[0201]3.5本发明物对模型大鼠脑组织β-EP含量的影响
[0202]
表10本发明物对模型大鼠脑组织β-EP含量的影响(n＝10)
16
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[0204]
[0205]
###***
模型对照组与空白对照组比较，P＜0.001，与模型对照组比较，P＜0.05，P＜
0.01。
模型对照组与空白对照组相比，脑组织内的β-EP含量下降趋势明显，有明显的统
计学差异(P<0.001)。本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比含量有所上升，但没有统计学差异。本发明物中剂量治疗组与模型对照组相比含量上升，有统计学差异(P<0.05)。本发明物高剂量治疗组和舒马普坦治疗组与模型对照组相比含量升高明显，有较明显的统计学差异(P<0.01)。
[0207]3.6各组大鼠脑组织HE染色光镜观察的结果[0208]空白对照组：大鼠脑组织解剖结构完整正常，神经元与神经纤维分布正常、无紊乱，无异常改变，未见水肿、细胞坏死及细胞凋亡现象。模型对照组：大鼠脑组织解剖结构基本正常，神经元与神经纤维无明显紊乱，部分区域可见轻度水肿现象，但未见细胞坏死及细胞凋亡现象。本发明物各剂量组与舒马普坦组大鼠脑组织解剖结构正常，神经元与神经纤维分布略紊乱，未见水肿、细胞坏死及细胞凋亡现象。以上病例结果提示，大鼠行为学的改变不是器质性病变导致，可能是功能性异常所引起。见图2。[0209]实验二 本发明物对模型大鼠c-fos和c-jun的影响[0210]1实验材料[0211]1.1实验动物
[0212]成年健康SD大鼠，雄性，共60只，体重220-260g，由吉林大学实验动物中心提供，动物许可证号为：SCXK-(吉)2011-0003。实验室饲养室温(24±1)℃，昼夜节律维持在照明12小时、黑暗12小时交替。所有大鼠在到达动物房后进行分笼，日常饮水和鼠粮均正常供应。实验人员在实验过程中时刻遵守《关于善待实验动物的指导性意见》。[0213]1.2实验试剂
[0206]
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[0214]
[0215]
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1.3实验器材
[0217]
[0218]
2实验方法
[0220]2.1实验分组及流程
[0221]66只雄性SD大鼠随机分为6组：空白对照组10只、模型对照组13只、本发明物低剂量组10只、本发明物中剂量组10只、本发明物高剂量组13只及琥珀酸舒马普坦组10只。[0222]本发明物低、中、高剂量组分别按剂量体重比0.9g/kg，1.8g/kg，3.6g/kg灌胃本发明物溶液，琥珀酸舒马普坦组按剂量体重比0.05g/kg灌胃琥珀酸舒马普坦片溶液，上述药物都用羧甲基纤维素钠溶液稀释，空白对照组及模型对照组灌胃等体积羧甲基纤维素钠溶液，各组均连续给药7天。在最后一次灌胃给药后半个小时进行造模，造模后对模型对照组和本发明物高剂量组每组随机选取三只进行iTRAQ/TMT定量蛋白质组表达谱分析，各组剩余10只，对大鼠进行灌流取材，进行免疫组化实验。[0223]2.2模型制备方法[0224]末次给药30分钟后，除空白对照组，其余各组大鼠给予按剂量体重比10mg/kg臀部皮下注射甘油，空白对照组大鼠臀部皮下注射等体积生理盐水。潜伏期后5min内，观察大鼠行为学变化，以出现双耳发红，前肢频繁挠头，爬笼次数增多，咬尾，往返运动为造模成功的标准。
[0225]2.3iTRAQ/TMT定量蛋白质组表达谱分析步骤[0226]2.3.1蛋白提取
[0227]从-80℃中取适量组织样品至液氮预冷的研钵中，加入液氮进行充分研磨，待研磨成粉末后，分别加入粉末4倍体积裂解缓冲液(8M尿素，1％蛋白酶抑制剂，3μM TSA，50mM NAM和2mM EDTA)，随后进行超声裂解。低温离心10min，转速12000g，用来除去样品中的细胞碎片，抽取上清液进行分装，用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。[0228]2.3.2胰酶酶解
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[0219]
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各样品蛋白溶液中根据质量比1:1加入GST和MBP两个标准蛋白，加入二硫苏糖醇
(DTT)使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺(IAA)使其终浓度为11mM，室温光孵育15min。最后将样品加TEAB使尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例(蛋白酶：蛋白)加入胰蛋白酶，酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰蛋白酶，继续酶解4h。
[0230]2.3.3TMT标记
[0231]胰酶酶解的肽段用StrataX C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5M TEAB溶解肽段，据TMT试剂盒操作说明标记肽段。简单的操作如下：TMT试剂解冻后用乙腈溶解，肽段混合后室温孵育2h，标记的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。[0232]2.3.4HPLC分级
[0233]肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent300Extend C18column(5μm particles，4.6mm ID，250mm length)。简单的操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为18个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。
[0234]2.3.5液相色谱-质谱联用分析
[0235]肽段用液相色谱流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；缓冲液B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：液相梯度设置：0～26min，7％-23％B；26～34min，23％-35％B；34～37min，35％-80％B；37～40min，80％B，流速维持在400nL/min。[0236]肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM Plus质谱仪进行分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描辨率设置为70000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，rbitrap扫描分辨率设置为17500。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用30％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，设置自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号值设置为10000ions/s，最大注入时间设置为200ms，串联谱扫描的动态排除时间设置为30秒避免母离子的重复扫描。[0237]2.3.6数据库搜索
[0238]二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行搜索。检索参数设置：数据库为Uniprot Rat(29795条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化。定量方法设置为TMT-6plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
[0239]2.3.7质谱数据的质量控制
[0240]图3-5中展示的是质谱数据的质控检测结果。首先，我们检测了所有鉴定到的肽段的质量偏移(mass error)(图3)。质量误差以0为中轴并且集中在低于10ppm的范围内，说明
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质量误差符合要求。其次，绝大部分的肽段长度分布在8-20个氨基酸残基之间(图4)，符合胰酶消化肽段的规律，说明样品制备达到标准。[0241]2.3.8蛋白质功能富集[0242]GO富集分析 蛋白的GO注释被分为3个大类：生物进程、细胞组成、分子功能。费歇尔确切双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景，在GO各分类下的富集程度，并使用多重假设检验校正方法控制富集检验结果的假阳性率。经过校正后的GO富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。[0243]通路富集分析Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库被用于通路的富集分析。费歇尔确切双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景，在各种通路中的富集程度，并使用多重假设检验校正方法控制富集检验结果的假阳性率。经过校正后的通路富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。最后根据KEGG网站通路层级分类方法将这些通路进行分类。
[0244]蛋白结构域富集分析InterPro(对蛋白序列的家族分类、结构域和特殊位点的预测等功能分析提供资源)数据库用于分析差异表达蛋白的功能结构域的富集情况。费歇尔确切双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景，在各结构域中的富集程度，并使用多重假设检验校正方法控制富集检验结果的假阳性率。经过校正后的结构域单元富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。[0245]2.3.9基于不同分组蛋白功能富集的聚类分析
[0246]基于不同分组的差异蛋白(或者不同差异倍数的差异蛋白)功能富集的聚类分析用于研究其在特定功能(GO，KEGG通路，蛋白结构域等)上存在的潜在联系和差异。我们首先收集所用蛋白分组富集到的功能分类信息和对应的富集P-value值，然后筛选出至少在一个蛋白分组中为显著富集(P-value<0.05)的功能分类。筛选得到的P-value数据矩阵首先经过以-log10的对数变换，然后将变换后的数据矩阵对各功能分类运用Z变换。最后将Z变换后得到的数据集使用分层聚类(欧式距离，平均连接聚类)方法做单边聚类分析。聚类关系使用R语言包gplots中的函数heatmap.2绘制出的热图进行可视化展示。[0247]2.4免疫组化操作步骤[0248]2.4.1标本制备
[0249]常温下用10％的水合氯醛按照3.5ml/kg体重对大鼠进行腹腔麻醉，麻醉成功后，将大鼠置于仰卧位，迅速开胸，暴露左心室。用灌流针从左心尖经左心室穿至升主动脉，动脉夹固定。随后用剪刀将右心耳剪开，打开蠕动泵开始灌流生理盐水，随时观察大鼠的肝脏颜色变化，待肝脏完全变白、右心耳流出澄清液体后，将生理盐水换成4％多聚甲醛先快后慢进行灌注，待大鼠出现舞蹈症，随后肢体僵硬提示灌流成功。将大鼠的脑完整取出放在多聚甲醛中，固定24小时，后放入20％蔗糖PBS溶液中，糖沉。组织块下沉后对其进行常规脱水，石蜡包埋。切片后进行常规HE染色，确定组织未被破坏后进行免疫组化染色。[0250]2.4.2染色步骤
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[0251]
[0252]
[0253]
2.4.3图像观察
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在光镜下对组织切片进行观察各组大鼠中脑导水管周围灰质区，细胞核位于胞浆
内，多为卵圆形、圆形或椭圆形，在镜下观察细胞核为棕黄色。高倍镜下随机选取大鼠脑片的5个不重叠的视野，在每个视野下对c-fos和c-jun的炎性细胞进行计数，并利用图像分析软件对视野的灰度进行分析。[0255]2.5统计学方法
[0256]
采用SPSS 19.0统计软件，数据结果以均数±标准差表示，若方差齐性检验
中方差齐，则多组间均数比较采用方差分析，若方差不齐，采用DunnettT3法。进一步两两比
较采用样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。[0257]3结果
[0258]3.1iTRAQ/TMT定量蛋白质组表达谱分析结果[0259]本项研究一共鉴定到6205个蛋白质，其中5396个蛋白质包含定量信息。如果设定ratio(治疗组/模型组)在不同的大小会得到不同的上调下调蛋白质数量的统计。基于上述数据，我们对包含定量信息的蛋白质进行了系统的生物信息学分析，包括蛋白注释、功能分类、功能富集及基于功能富集的聚类分析。并综合以上信息，对下游基于蛋白质组的深入研究提供了参考方向。
[0260]3.1.1蛋白提取结果[0261]表11各样品蛋白浓度、体积及总量
[0262]
样品名称模型组处理组蛋白浓度(μg/μl)5.848.58体积(μl)800800总质量(μg)467268[0263]蛋白提取量见表11，SDS-PAGE电泳结果如图6。根据图6所示的结果，可以看到蛋白条带清晰、样品间平行性良好、表明蛋白提取效果良好。[02]3.1.2定量数据总览[0265]在本项目实验中，共有6205个蛋白质被鉴定到，其中5396个蛋白质具有定量信息(图7)。
[0266]表12蛋白鉴定和定量的统计信息
[0267]
鉴定定量62055396
[0268]以差异倍数值变化超过1.2倍作为显著上调、小于0.83作为显著下调的变化标准，本项目数据中所有差异表达(Differentially expressed，以下简称DE)的蛋白汇总数据参见表13。
[0269]表13差异表达蛋白统计信息
[0270]
蛋白数
比较组
treat/model
[0271]注:p值<0.05。
上调(>1.2)234下调(<0.83)120
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3.1.3差异表达蛋白的功能富集分析
[0273]对于鉴定到的全体蛋白的注释以及差异表达蛋白的筛选，我们进行了GO、KEGG、蛋白结构域(domain)等功能注释类型的富集分析，目的是检测差异表达的蛋白是否在某些功能类型有显著性的富集趋势。对于富集检验(此处运用Fisher's exact test即费希尔精确检验)得到的p值进行负对数(-log10)转换，即得到转换后的值越大则此功能类型的富集越显著。结果见图8-11图。
[0274]KEGG是连接已知分子间相互作用的信息网络，如代谢通路、复合物、生化反应。KEGG途径主要包括：代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病、药物开发等。富集分析得到的KEGG通路可以网页形式进行可视化展示。
[0275]蛋白质结构域是指在不同蛋白质分子中重复出现的某些组分，具有相似的序列、结构和功能，是蛋白质进化的单元。结构域的长度通常在25个氨基酸和500个氨基酸长度之间。
[0276]3.1.4聚类分析
[0277]在将不同比较组中的差异蛋白进行GO分类、KEGG通路及蛋白结构域的富集后，我们对其进行聚类分析，旨在找到比较组中差异蛋白功能的相关性。结果见图12-14。[0278]对于差异表达的蛋白，我们根据其差异表达倍数将其分成了4个部分，称为Q1到Q4：Q1(0 [0280]3.2本发明物对模型大鼠中脑导水管周围灰质中c-fos和c-jun基因表达的影响 [0281] 表14本发明物对模型大鼠中脑导水管周围灰质中c-fos阳性细胞数的影响( n＝10) [0282] 组别剂量(g/kg)c-fos(个)空白对照组-19.25±2.74模型对照组-43.81±4.34***本发明物低剂量组0.941.±5.16本发明物中剂量组1.838.57±4.68#本发明物高剂量组3.634.51±5.29##舒马普坦组0.0531.84±3.98## ***###[0283]模型对照组与空白对照组比较，P＜0.001；与模型对照组比较，P＜0.05，P＜ 0.01。 [0284]空白对照组可观察到一定数量的阳性细胞，模型对照组中的c-fos阳性细胞的数 24 CN 108465058 A 说 明 书 23/30页 量明显增多，跟空白对照组有极显著差异(p＜0.001)；本发明物高剂量治疗组和舒马普坦治疗组中的c-fos阳性细胞数较少，与模型对照组相比有极显著性差异(p＜0.01)；本发明物中剂量组与模型对照组相比有显著性差异(p＜0.05)；本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比阳性细胞数减少，但并没有显著性差异。 [0285] 表15本发明物对模型大鼠中脑导水管周围灰质中c-jun阳性细胞数的影响(n ＝10) [0286] 组别剂量(g/kg)c-jun(个)空白对照组-31.52±6.15模型对照组-52.19±3.34***本发明物低剂量组0.950.34±6.21本发明物中剂量组1.847.95±5.34本发明物高剂量组3.2.65±6.19#舒马普坦组0.00.34±4.61## ***###[0287]模型对照组与空白对照组比较，P＜0.001；与模型对照组比较，P＜0.05，P＜ 0.01。 [0288]空白对照组可观察到一定数量的阳性细胞，模型对照组中的c-jun阳性细胞的数量明显增多，跟空白对照组有极显著差异(p＜0.001)；舒马普坦治疗组中的c-jun阳性细胞数较少，与模型对照组相比有极显著性差异(p＜0.01)；本发明物高剂量治疗组和模型对照组相比有显著性差异(p＜0.05)；本发明物中剂量组与本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比阳性细胞数减少，但并没有显著性差异。 [02]表16本发明物对模型大鼠中脑导水管周围灰质中c-fos阳性细胞灰度的影响( n＝10) [0290] 组别剂量(g/kg)c-fos(个)空白对照组-135.19±24.16模型对照组-97.15±19.62***本发明物低剂量组0.9113.±23.14本发明物中剂量组1.8117.39±22.94本发明物高剂量组3.6121.±31.#舒马普坦组0.05126.57±29.# **#[0291]模型对照组与空白对照组比较，P＜0.01；与模型对照组比较，P＜0.05。 [0292]模型对照组中c-fos阳性细胞灰度在造模后与空白对照组相比有明显减弱，有统计学意义(p＜0.01)。本发明物高剂量治疗组和舒马普坦治疗组中的c-fos阳性细胞灰度，与模型对照组相比有显著性差异(p＜0.05)。本发明物中剂量组与本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比阳性细胞灰度有变化，但并没有显著性差异。见图15。 [0293]表17本发明物对模型大鼠中脑导水管周围灰质中c-jun阳性细胞灰度的影响( n＝10) 25 CN 108465058 A[0294] 说 明 书 24/30页 组别剂量(g/kg)c-jun(个)空白对照组-168.34±26.16模型对照组-106.17±24.35***本发明物低剂量组0.9124.61±26.17本发明物中剂量组1.8134.59±35.16本发明物高剂量组3.6146.16±19.#舒马普坦组0.05151.97±24.16# ***#[0295]模型对照组与空白对照组比较，P＜0.001；与模型对照组比较，P＜0.05。 [0296]模型对照组中c-jun阳性细胞灰度在造模后与空白对照组相比有明显减弱，有统计学意义(p＜0.001)。本发明物高剂量治疗组和舒马普坦治疗组中的c-jun阳性细胞灰度，与模型对照组相比有显著性差异(p＜0.01)。本发明物中剂量组与本发明物低剂量治疗组与模型对照组相比阳性细胞灰度有变化，但并没有显著性差异。见图16。[0297]三、本发明物安全性试验 [0298]观察本发明物大剂量给予动物后，所产生的毒性反应情况和死亡情况。[0299]动物：SD大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。合格证号：SCXK(吉)2012-0004。 [0300]本发明物：长春中医药大学提供，批号：20160202[0301]将本发明物配制成：称取一定量供试品，缓慢加入溶媒，使用玻璃棒不断搅拌，使用16G灌胃针头进行抽取，选择针头可以抽取的浓度为最大可行浓度。经测定，供试品最高可行浓度为800mg/ml，设定最大给药容积为20ml/kg，得最大给药剂量为16000mg/kg。同法测得糊精最高可行浓度为493mg/ml，最大糊精给药剂量为9860mg/kg。[0302]1.试验方法[0303]1.1给药途径、剂量、次数、分组及动物识别[0304]给药途径及次数：经口灌胃给药1次，上午进行。[0305]给药剂量：辅料对照组给予糊精，给药组给予供试品。糊精及供试品给药剂量均为最大剂量。 [0306]最大给药剂量＝最高可行浓度×最大给药容积[0307]剂量设计理由：本品处方组成为传统中药或天然药，毒性较低，故采用最大给药量法设计剂量。 [0308]分组方法：按动物性别，每性别淘汰体重过大或过小的2只，使用EXCEL2007软件的RAND()函数为剩余10只动物每只分配1个0-1之间的随机数；再将动物号和随机数复制，以“粘贴值”的方式粘贴到另外一个工作表中，选中动物号及随机数所在的区域，按照随机数从小到大顺序排列，最小的5只动物分配到对照组，剩余的5只动物分配到给药组。[0309]动物识别：使用黄色动物专用记号笔被毛标识和使用笼卡识别，辅料对照组动物使用白色笼卡，给药组动物使用红色笼卡。笼卡上注明动物性别、组别、引入日期、给药日期、剂量、项目负责人等信息。[0310]分组及动物识别日期：于给药日进行分组并识别。[0311]1.2观察、体重、大体解剖 26 CN 108465058 A[0312] 说 明 书 25/30页 观察内容：记录动物被毛变化、眼和黏膜、呼吸系统、循环系统、神经消化系统变 化。在给药日对所有动物进行详细观察，其余时间进行一般观察。[0313]观察时间：给药首日，药后1、2、4小时内进行观察，此后每日进行1次观察，连续观察14天。 [0314]体重测定：D0(给药日)、D3、D7和D14进行体重称量。[0315]大体解剖及组织病理学检查：对试验结束存活动物进行大体解剖，包括胸腔、腹腔、各个天然孔道及其内容物，记录每只动物的大体病理改变。[0316]1.3数据处理和结果评价[0317]用表格列出试验中获得的各组动物的全部原始数据，内容应包括动物编号、性别、给药剂量、体重、临床观察结果和大体解剖结果。[0318]使用EXCEL 2007的组间Student t方法比较辅料对照组和给药组体重及增重。[0319]2试验结果与结论[0320]2.1试验结果[0321]2.1.1体重 [0322]分组日辅料对照组动物和给药组雌雄动物体重对比没有统计学意义差异。[0323]药后第D3、D7和D14称量，给药组与辅料对照组雌雄性动物体重无统计学意义差异，药后第D0-D3、D3-D7和D7-D14体重增重辅料对照组雌雄性动物体重无统计学意义差异。[0324]体重和体重增重统计结果和个体值详见附录表18～表19。[0325]2.1.2症状观察[0326]给药日药后1h、2h和4h详细观察，两组动物均未见异常；在药后D1～D14观察，辅料对照组动物均未见异常变化，给药组动物在给药次日均发现有黑褐色便外，其余时间观察均未见异常变化。整个试验过程中未见动物死亡。 [0327]给药组动物的黑褐色便有可能与药物的颜色有关，可能非毒性反应。[0328]症状观察结果见表20～表23。[0329]2.1.3大体解剖 [0330]试验结束所有存活动物CO2麻醉后腹主动脉放血进行大体解剖，检查了气管、食道、胸腺、肺脏、心脏、胃、肠(十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠)、肝脏、胰腺(含胰岛)、肾、肾上腺、脾脏、膀胱、雄性动物的睾丸、附睾、精囊和雌性动物的卵巢、子宫和阴道，结果均未见异常。结果见表24。[0331]2.2试验结论 [0332]在本试验条件下，当归川葛颗粒以16000mg/kg的剂量对SD大鼠灌胃给药1次，连续观察14天，未见对动物产生明显的毒性反应，其LD50>16000mg/kg。 [0333] 表18对动物体重(g)的影响(n＝5) 27 CN 108465058 A 说 明 书 26/30页 [0334] [0335][0336] 注：经组间t检验，给药组与辅料对照组比较，雌雄动物均P>0.05。表19对动物体重增重(g)的影响( n＝5) [0337] [0338][0339][0340][0341] 注：经组间t检验，给药组与辅料对照组比较，雌雄动物均P>0.05。表20药后1h动物详细症状观察记录 28 CN 108465058 A[0342][0343][0344] 说 明 书 27/30页 注：N代表未见异常，下同。 表21药后2h动物详细症状观察记录 [0345] [0346] 表22药后4h动物详细症状观察记录 29 CN 108465058 A[0347] 说 明 书 28/30页 [0348] [0349] 表23动物症状观察记录 30 CN 108465058 A[0350] 说 明 书 29/30页 [0351][0352] 注：F代表黑褐色便。表24解剖所见结果 [0353] 31 CN 108465058 A 说 明 书 30/30页 [03] [0355] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 32 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 1/14页 图1 33 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 2/14页 图2 34 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 3/14页 图3 图4 35 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 4/14页 图5 图6 36 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 5/14页 图7 37 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 6/14页 38 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 7/14页 图8 39 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 8/14页 图9 40 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 9/14页 图10 41 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 10/14页 图11 图12 42 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 11/14页 图13 43 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 12/14页 图14 44 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 13/14页 图15 45 CN 108465058 A 说 明 书 附 图 14/14页 图16 46 因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容
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