SUR1过表达实验设计方案

一实验目的：使SUR1基因在植物体内超表达 二实验方法：

三实验步骤

① RT-PCR将RNA反转录成CDNA RNA提取（-70℃保存）

1. 组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停） 2. 转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min 3. 加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min 4. 10000 rpm 4℃离心15min

5. 转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min

6. 12000rpm 4℃ 离心15min

7. 倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，10000rpm 4℃ 离心5min

8. 倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥 9. 加20ul DEPC水至EP管中

10.在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解 逆转录

以Fernentas试剂盒为例，反应体系20ul 1. RNA短暂离心

2. 将11ul的DEPC水和RNA（1ug）放入EP管内，置于冰上，使RNA终浓度为0.5ug/ul,再加入Oligo(dt) 1ul,轻轻混合均匀，短时间离心

(RNA=1/总RNA浓度=1/ OD260×6 ；DEPC水=11-RNA) 3. 将反应液置于65℃ 5min 冰上1min,短时间离心 4. 按顺序加入：

5×buffer 4ul 200ul核糖核苷酸酶抑制剂 1ul 10mm dNTP MIX 2ul M-Mulu逆转录酶 1ul 轻轻混合均匀，短时间离心 5. 将混合物置于42℃，60min

6. 70℃加热5min,中止上述反应，置于冰上

② 据序列设计引物对CDNA进行PCR扩增 在TAIR上查出SUR1的序列

1 ATGAGCGAAG AACAACCACA CGCCAATCTA GCGGTTCCCG CGTTTAAAAC 51 TGAGAAAGAG CCCATAACGC AAACACGAAA TGGTCAAAGT AGCGTTTGGC 101 GTTTCGGTGG AAGTGATAAG GCAGCGAAAG CATCCACCGT AACGCTTAGA 151 GGTGTCATCT ACATGCTCTT CGACAACTGC GGCAAAGACG TCAATAAGAC 201 CATTTTACCC CTCGGCCACG GTGACCCTTC CGTCTACCCT TGCTTCCGTA 251 CCTGTATCGA AGCTGAAGAC GCCGTCGTCG ACGTCCTTCG CTCCGGCAAA 301 GGCAATTCTT ACGGTCCCGG AGCTGGGATT CTCCCCGCAA GACGAGCCGT 351 TGCTGATTAT ATGAACCGAG ATCTTCCGCA CAAGTTAACG CCTGAAGATA 401 TTTTTCTGAC CGCTGGATGC AACCAAGGGA TAGAGATCGT GTTCGAATCG 451 TTGGCTCGAC CAAACGCAAA CATCTTGCTC CCACGTCCTG GCTTCCCTCA 501 CTACGACGCT CGTGCTGCTT ACAGTGGTCT CGAGGTTCGC AAGTTTGATC 551 TTCTTCCCGA GAAAGAATGG GAGATTGATC TTGAAGGTAT CGAAGCCATT 601 GCAGACGAGA ACACTGTGGC TATGGTTGTA ATTAACCCCA ACAATCCCTG 651 TGGAAATGTC TACTCTCACG ACCATCTCAA AAAGGTTGCA GAGACGGCTA 701 GGAAGCTCGG GATAATGGTG ATCTCAGACG AAGTATATGA CCGAACTATA 751 TTCGGAGACA ATCCATTTGT TTCAATGGGG AAGTTTGCTT CGATAGTCCC 801 TGTATTGACA CTAGCAGGCA TATCTAAGGG ATGGGTTGTT CCTGGATGGA

851 AAATTGGCTG GATCGCCTTG AATGATCCCG AGGGCGTTTT CGAGACCACC 901 AAGGTGTTAC AATCCATCAA ACAGAATCTT GACGTAACTC CTGACCCTGC 951 CACAATAATT CAGGCTGCAC TTCCAGCGAT CCTGGAGAAA GCGGACAAAA 1001 ACTTCTTTGC AAAGAAGAAC AAGATACTCA AACATAATGT TGATTTGGTG 1051 TGTGATAGGC TCAAGGACAT CCCCTGTGTC GTCTGTCCCA AGAAACCTGA 1101 GTCTTGCACT TACTTATTGA CAAAGTTGGA GCTGTCATTG ATGGATAATA 1151 TCAAGGACGA TATAGATTTT TGCGTAAAAC TGGCCAGAGA GGAGAATCTC 1201 GTGTTTCTAC CAGGGGATGC TCTGGGTTTG AAGAACTGGA TGAGGATAAC 1251 CATCGGAGTC GAAGCTCATA TGCTTGAGGA TGCACTTGAG AGACTGAAGG 1301 GTTTCTGTAC ACGTCATGCC AAGAAGACAG AGACAGAAAC TGAGTCACTT 1351 CAAGCTTTGA AACTGAGTGA TAATAATCTC GAAATGTAA

根据引物设计原则，利用软件Primer premier 5.0设计上下游引物 进行PCR扩增得到目的基因SUR1

③ 载体的构建

图1：过表达载体

User载体的连接

User酶：1ul 载体：1ul PCR产物：10ul

将混匀的产物于37℃放置25min,再25℃放置25min，完成后加入感受态大肠杆菌中。

大肠杆菌感受态转化 LB培养基（1L）：蛋白胨10g

酵母提取物（Yest）5g NaCl5g 固体LB：0.75g琼脂/50ml 高压灭菌14min 感受态转化：

1.-70℃取感受态，冰上融化在超净台中加入载体

2.冰上静止30min，42℃水浴热激90s，冰置90s,42℃水浴30s 3.在超净台中加入800ul液体LB，37℃，100r/m1h，活化菌

4.准备涂菌用的平板，融化固体LB，不烫手时加入选择抗生素，迅速摇匀并倒平板，冷却至凝固

5.将活化后的菌4000r/m离心沉淀，其大部分上清，剩约100ul重悬，用移液枪吹起菌体，转移到平板上

6.烧涂布棒，前端放在平板盖内侧冷却后，将菌液均匀涂布在平板上，封上封口膜

7.培养箱37℃倒置培养12~16h 8.菌落PCR鉴定

（50mlLB中加入50ul卡那霉素）

④ 测序

测序与已知序列一致进行下一步

⑤ 转化农杆菌

重组表达载体导人农杆菌。用电转化法将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中，电转化参数为：电压2 500 kV／em；电容25 F；电阻500 Q。电击3～5 ms后，取出电击杯，迅速加入800 L的LB液体培养基，混匀并转移至1．5 mL的EP管中，在28℃震荡培养3 h；取100／,L菌液涂布于含Gen(50／,g／mL)和Kan(50／,g／mL)的LB平板中28℃培养24 h，即可长出阳性克隆。 阳性克隆的菌落PCR与酶切鉴定。随机挑取单菌落，在装有1 mL的LB和1．5 mL的抗生素的离心管中28℃培养12 h左右。取5O L培养物，煮沸5 rain，5 000 r／rain离心2 min，取1～2／,L上清进行PCR扩增后电泳检测。选取菌落PCR验证后的菌液抽提质粒，并用BstE 1I和Bgl 1I双酶切后，电泳检测。

⑥农杆菌浸染法侵染拟南芥 前期准备：

取150ml 含相应抗生素的液体LB培养基，接入2-3ml准备好的农杆菌菌液，大摇过夜至培养基由红色转为黄色。将培养后的150ul农杆菌菌液导入灭过菌的50ml离心管中，4℃，3000rmp离心15min弃上清，加入50ml 1／2 MS，将菌泥搅起。

用于侵染的1／2 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 1／2 MS液）

MS大量 5 ml 蔗糖 10 g 水 95 ml 表面活性剂 20 ul

常用1／2 MS配方（1 L）：

10X大量元素 50 ml 100X微量元素 5 ml 100X铁盐 5 ml 蔗糖（1%） 10 g 琼脂粉 8 g

拟南芥生长土壤：

腐殖土：蛭石=1:1混匀，装双层袋子，高压121℃灭菌40分钟

注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。

种子消毒：

30%H2O2+85%乙醇 1:4混合

取250微升混合液加入种子种用枪头吹打40S，放在滤纸上晾干，然后铺在1／2 MS平板上。4℃冰箱中放置春花1-5天，一般新种子春花时间长点。16\\8 光周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。

后续操作

1 种植健康的拟南芥直到开花。在种子种下后浇水盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜。 2 初次开花时将花蕾剪掉以促进更多花枝的增生，修剪后越4至5天可使用，这样优化后的植物含有很多未成熟的花序并没有很多受精的角果，以保证大多数植物被成功的转化。

3准备携带目的基因在双元载体（双元载体有两套筛选引子，菌体中用一种，植物中用一种）里的农杆菌菌株。养殖在一个大的液体LB培养基中，培养基带有抗生素，以为筛选二元质粒。

4 摇床摇农杆菌，用5%的蔗糖溶液（蔗糖溶液中加入表明活性剂，达到浓度0.05%）混悬到OD600 = 0.8（左右）把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵染2分钟，侵染的过程要转动钵子，（侵染之前一晚上最好给钵子里浇些水，以免第二天侵染后钵子里的土容易掉出来），侵染后用滤纸擦干。

5 侵染后的拟南芥用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时后继续光照。侵染后悉心照料，保持水分充足。一周后可再侵染一次，这是由于拟南芥的盛花期较长，一般要侵染2—3次。

6 浇水松土正常养殖，种子成熟后停止浇水。

7 角果自然开裂后收获干燥的种子，独立分装备用。 筛选

Basta筛选转基因拟南芥

收获后的干燥种子经表面消毒，放于4℃冰箱，春化4天后，播种于培养土中，待长出2片真叶后，喷洒1：1 000的Basta除草剂进行筛选。设计特性引物，采用RT_PcR方法对具有Basta抗性的拟南芥转基因植株进行鉴定。

⑥ 分子检测

收获种子进行自交，在T2或T3代进行分子检测 采用半定量PCR的方法 6.1总RNA的提取：同第一步 6.2基因组DNA的去除

RNA样品中痕量的基因组DNA的去除方法参照DNase I(RNase Free)试剂说明书进行。对除去基因组DNA的总RNA样品稀释后测定DD260nm和0D280nm，计算RNA的浓度。对初提及去除基因组DNA的总RNA样品各取5μl，2％琼脂糖凝胶，110v电压，l0min电泳后拍照。 6.3 第一条链cDNA合成 ①冰上按以下次序配置体系 Total RNA 0.1ng-5μg

Primer(random hexamer primer) 1μL Water,nuclease-free 合计 12μL

②将体系轻柔混合短暂离心后，在PCR仪进行以下程序：65℃，5min后4℃，5min； ③顺次加

5×Reaction buffer 4μL

Rnase inhibitor(20u/μL) 1μL 10Mm dNTP Mix 2μL

Reverse Transcriptase(200 u/μL) 1μL ④将体系轻柔混合短暂离心,在PCR仪进行以下程序：25℃，5min；42℃，60min；70℃，5min。

6.4.内参基因和目的基因引物设计 内参基因需是看家基因，目的基因要求PCR产物在350-800bp之间，且退火温度和内参基因引物的退火温度保持一致。 6.5.内参基因和目的基因退火温度的确定

进行不同的变性温度梯度PCR，内参基因和目的基因分管做，PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳

6.6.PCR循环数的确定

按普通 PCR循环，设定为34个循环，内参基因和目的和目的基因分管作，内参和目的基因都做6管，在 PCR 的第18、20、22、24、36、28、30、32、34 个循环各拿出1管，一起跑电泳。选择循环次数在线性范围内，且电泳效果好的次数作为最佳循环次数。

电泳显示目的基因片段非常亮，而管家基因亮度一般则认为靶基因得到了超表达

SUR1过表达实验设计方案