单宁酸通过内质网应激途径增强顺铂抗肝癌细胞HepG2的作用

用

耿娜娜;吴明松;郑翔;杨蕾;王宏阳;李学英

【摘 要】目的 探讨单宁酸(TA)与顺铂(CDDP)协同抗肝癌细胞HepG2的作用及其内质网应激(ERS)通路的激活情况.方法 将人肝癌细胞HepG2分为对照组、TA组、CDDP组、TA+ CDDP组(联合组),并在体外培养24 h.MTT法测定药物对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用;药物联合作用指数、药物剂量降低指数和等效图解法分析两药物之间药效学的协同作用;4'6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞核变化;实时荧光定量PCR(q-RT-PCR)和免疫印迹检测ERS标志分子葡萄糖调节蛋白(GRP) 78、GRP94的水平.结果 TA和CDDP对HepG2细胞生长均呈剂量依赖性抑制作用,其半数有效浓度(IC50)分别为360.00 μmol/L和1.80 μg/mL;用180.00μmol/L TA和0.90 μg/mL CDDP联合处理肝癌HepG2细胞后,能够加强对细胞生长的抑制作用;TA和CDDP具有协同抑制肝癌细胞生长的作用.与TA、CDDP组比较,联合组细胞皱缩、变圆加剧且凋亡细胞增多,细胞核固缩、边缘不规则、致密浓染及核裂解碎片增多;细胞GRP78、GRP94的表达均上升.结论 TA能够增强CDDP的抗肝癌HepG2细胞作用,该协同作用的机制可能与激活ERS通路有关.%Objective To investigate the synergistic effects of tannic acid(TA) and cis-dichlorodiamine platinum(CDDP) on hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its activation situation of endoplasmic reticulum stress(ERS) pathway.Methods Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were divided into the control group,TA group,CDDP group and TA+CDDP group,and were cultured in vitro for 24 h.The growth inhibitory effect of medication on HepG2 cells was detected by MTT assay.The

pharmacodynamics synergistic effect between the two drugs was analyzed by the drug interaction index,drug dose reduction index and equivalent graphical method.The nucleus changes were observed by DAPI

staining.Real time fluorescent quantitative PCR(q-RT-PCR) and Western blot were used to detect the levels of ERS markers glucose regulated protein (GRP)78 and GRP94.Results TA and CDDP had dose-dependent growth inhibition effect on HepG2 cells,their median effective

concentrations(IC50) were 360.00 μmol/L and 1.80 μg/mL respectively.The combination treatment of 180.00 μmol/L TA and 0.90 μg/mL CDDP on HepG2 cells could enhance the inhibitory effect on cell growth.Ta and CDDP had synergistic effect for inhibiting hepatocellular carcinoma cells growth.Compared with the TA group and CDDP group,cell shrinkage and rounding were accelerated in the combined group,apoptotic cells were increased,nuclear had pyknosis,irregular edge and dense staining,nuclear fragmentations were increased and the expressions of GRP78 and GRP94 were up-regulated.Conclusion TA can enhance the effect of CDDP on anti-hepatic carcinoma HepG2 cells,and the synergy mechanism may be related to the activation of ERS pathway. 【期刊名称】《重庆医学》 【年(卷),期】2018(047)005 【总页数】5页(P594-597,600)

【关键词】单宁酸;顺铂;药物协同作用;肝肿瘤;细胞凋亡;内质网应激

【作 者】耿娜娜;吴明松;郑翔;杨蕾;王宏阳;李学英

【作者单位】遵义医学院口腔学院,贵州遵义 563000;贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室/遵义医学院医学与生物学研究中心,贵州遵义 563000;遵义医学院口腔学院,贵州遵义 563000;贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室/遵义医学院医学与生物学研究中心,贵州遵义 563000;遵义医学院医学遗传学教研室,贵州遵义 563000;遵义医学院医学遗传学教研室,贵州遵义 563000;遵义医学院医学遗传学教研室,贵州遵义 563000;遵义医学院医学遗传学教研室,贵州遵义 563000;遵义医学院医学遗传学教研室,贵州遵义 563000 【正文语种】中 文 【中图分类】R979.1+9

有研究显示，2015年中国肝癌男女新发病分别为343 700例和122 300例，其中男性死亡310 600例，女性死亡111 500例，占癌症相关死因的17.2 %和11.1 %[1]。原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)在我国发病率较高，其中肝细胞癌(hepatic carcinoma，HCC)占PLC的90%以上[2-3]。顺铂(cis-dichlorodiamine platinum，CDDP)是治疗HCC的主要药物之一，但其单药有效率比较低[3]，毒副作用也较大。研究表明，单宁酸(tannic acid，TA)可与其他药物协同发挥抗癌作用，如与丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶联用抗胆管癌[4]，与三氧化二砷(As2O3)联用抗人类白血病[5]，与CDDP联用抗卵巢癌[6]等。此外，TA能够抑制人肝癌HepG2细胞的生长增殖[7-9]，但其分子机制尚不清楚。有研究表明口服TA较为安全，并被作为食品添加物[6]。因此，TA可能作为一种低毒的化疗药物增敏药物，参与癌症的预防和治疗。

内质网主要负责蛋白质的合成、修饰与转运、信号转导等，当这些过程受到干扰时，会导致蛋白质的折叠、翻译后修饰、基因表达等发生紊乱，从而引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[10]。ERS介导的细胞凋亡与众多癌症的发生、发展等有关联[11-12]。研究表明，CDDP能够通过激活ERS促进肝癌HepG2细胞的凋亡[13]。TA是否能够协同增强CDDP抗肝癌，并通过ERS途径诱导肝癌细胞凋亡，尚少见报道。本研究旨在探讨TA协同增强CDDP抗肝癌HepG2细胞的作用，并通过体外实验探索ERS凋亡通路在该协同效应中的作用。 1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株HepG2，来源于中国科学院细胞库。TA(C76H52O46，含量大于或等于95%)购自Sigma公司，CDDP注射液[Cl2(NH3)2Pt]购自山东齐鲁制药公司，RPMI-10培养基购自Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技有限公司，噻唑蓝(MTT)购自BBI公司，4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自Biosharp公司，M-MLV逆转录酶购自Promega公司，dNTP Mix(10 mmol/L)购自上海生工生物公司，RNAiso TM Plus购自TaKaRa Biotechnology公司，PCR引物(表1)由上海生工生物公司合成，Sso Fast Eva Green supermix实时荧光定量PCR(q-RT-PCR)试剂盒购自Bio-Rad公司，鼠抗人葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein，GRP)94单抗、兔抗人GRP78多抗和兔抗人β-actin单抗、辣根过氧化物酶标记的多抗均购自Protein-Tech Group公司。酶标仪Model 680、PCR仪CFX Connect TM Optics Module均购自Bio-Rad公司，倒置荧光显微镜IX73购自Olympus公司，超微量分光光度计Nanodrop 2000购自Thermo Scientific公司，GOLD-SIM二氧化碳培养箱购自西盟国际公司。 表1 PCR引物序列及扩增长度基因引物序列(5′⁃3′)产物长度(bp)β⁃actin正向CGGGAAATCGTGCGTGAC反向CAGGAAGGAAGGCTGGAAG186GRP94正向CTGGGACTGGGAACTTATGAATG反向

TCCATATTCGTCAAACAGACCAC217GRP78正向

TCAAGTTCTTGCCGTTCAAGG反向AAATAAGCCTCAGCGGTTTCTT148 1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人肝癌细胞系HepG2培养于含10% FBS、2.0 g/L NaHCO3、100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素的RPMI-10培养基中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2～3 天传代1次。

1.2.2 细胞的生长抑制作用 采用MTT法检测并计算细胞的存活率[14]。取对数生长期HepG2细胞接种于96孔培养板中，每孔1×104个。静置培养24 h后，分别加TA 0(对照组)、90.00、180.00、270.00、360.00、450.00、0.00 μmol/L和CDDP 0(对照组)、0.60、1.20、1.80、2.40、3.00、3.60 μg/mL，每组设5个复孔。继续培养24 h后，每孔加入10.00 μL浓度为5.00 mg/mL 的MTT溶液；再培养4 h后，弃上清液，每孔中加入100.00 μL二甲基亚砜，轻轻振荡10 min。用酶标仪测定570 nm波长下各样品的吸光度(A)值，各复孔的A取平均值，计算细胞的存活率，其中空白对照组细胞存活率记为100%。用等效线图解法观察TA和CDDP的协同作用，其中等效线图中的斜线为两种药物联合产生100%最大抑制效应时的相加等效线，当二者的剂量比例点位于等效线上时，表现为相加作用；位于等效线下方，表现为协同作用；位于等效线上方，表现为拮抗作用。药物的协同作用还可通过药物联合作用指数(combination index，CI)和药物剂量降低指数(dose reduction index，DRI)来判断[15]。以(D)1和(D)2表示两种药物联用达到某一特定生长抑制率时的使用浓度；(DX)1和(DX)2表示达到与联合用药相同的生长抑制率时，两种药物单独使用的浓度。CI<1表明药物具有协同作用；CI=1表明药物具有相加作用；CI>1表明药物具有拮抗作用。DRI表示在给定的抑制率下，与药物单独使用相比较，药物联合使用达到同一抑制率时，药物剂量所降低的倍数。计算公式如下：

细胞存活率(%)=(实验组A值-阴性对照组A值)/(空白对照组A值-阴性对照组A值) (1)

CI=(D)1/(DX)1+(D)2/(DX)2 (2)

(DRI)1=(DX)1/(D)1 (3)

(DRI)2=(DX)2/(D)2 (4)

1.2.3 细胞形态与细胞核变化的观察 DAPI是一种能够穿透细胞膜与核DNA结合的荧光染料，可用于检测细胞核的形态变化和细胞凋亡，正常的细胞核较为完整，染色质均匀；而凋亡细胞的染色质发生固缩，边缘化，严重时发生细胞核裂解，产生核碎片等。取对数期HepG2细胞接种于6孔板，每孔3×105个(接种约3.00 mL)。药物处理24 h后，经丙酮固定，DAPI染色后，于显微镜下观察细胞和细胞核的形态，并照相。

1.2.4 q-RT-PCR检测 药物处理24 h后，收集细胞，提取细胞总RNA，根据试剂盒方法，逆转录合成cDNA。q-RT-PCR反应体系体积为10.00 μL，包括cDNA 1.00 μL、Sso Fast Eva Green supermix 5.00 μL，上游引物0.50 μL，下游引物0.50 μL，无菌水3.00 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性60 s；95 ℃变性20 s，56 ℃(GRP78和β-actin)或63.5 ℃(GRP94)退火30 s，40个循环周期。每个样品设置3管重复。以β-actin作为内参，采用2-△△CT的方法，用3次重复的平均值计算基因相对表达量。

1.2.5 Western blot检测 药物处理24 h后，提取细胞总蛋白质，采用BCA法测定蛋白质的浓度，取一定体积量蛋白样品，进行变性、电泳、转膜、封闭、孵育一

抗(GRP78 1∶2 000；GRP94 1∶2 000；β-actin 1∶10 000)和二抗(1∶2 000)、曝光与显影，晾干。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件，计量资料以表示，用IPP软件分析蛋白免疫印迹条带灰度值，两组间比较采用样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果

2.1 TA与CDDP协同抑制肝癌细胞生长 TA和CDDP均能明显抑制HepG2细胞的存活率，且均呈剂量性依赖(P<0.01)，TA和CDDP的半数抑制率(IC50)浓度分别为360.00 μmol/L(TA组，图1A)和1.80 μg/mL(CDDP组，图1B)。采用两种药物IC50一半浓度的方法联合处理HepG2细胞，TA、CDDP组对HepG2的抑制率分别为(19.10±6.00)%、(17.50±4.00)%，而TA 360.00 μmol/L+CDDP 1.80 μg/mL(联合组)抑制率为(60.30±2.00)%，明显高于TA、 CDDP组(P<0.01)，见图1C。等效线图中TA与CDDP的剂量比例点绝大多数位于等效线下方(图1D)。不同剂量的TA与CDDP联用产生的抑制率为9.00%～70.00%(IC9～IC70)时，其CI分别为0.44、0.48、0.70、0.75、1.35，大多数均小于1；不同比例的TA与CDDP联用的DRI分为1.40～4.00和1.60～5.30，见表2。

A:单纯TA；B：单纯CDDP;C:二者联用；D：规范化等效线图解法；a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组(0)比较；c：P<0.01，与联合组比较 图1 不同剂量TA与CDDP对肝癌HepG2细胞生长的抑制作用 图2 各组肝癌HepG2细胞的形态及细胞核变化

表2 TA与CDDP的CI与DRI情况抑制率(%)CITA(μmol/L)单用联用DRICDDP(μg/mL)单用联用

DRI9．000．4490．0022．504．000．600．115．3022．000．48180．004

5．004．001．000．234．4032．000．70240．0090．002．701．400．453．1061．000．750．00180．002．502．600．902．9070．001．35510．00360．001．402．801．801．60

2.2 TA增加CDDP的促肝癌细胞凋亡作用 凋亡细胞的基本形态变化主要有：细胞体变小、变圆，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞质浓缩，折光度降低等。药物处理24 h后，对照组细胞贴壁良好，呈梭形或多角形，轮廓较为清晰，折光度均一；TA、CDDP组部分细胞开始脱壁，细胞体积皱缩、变圆，折光度降低；联合组出现大量脱壁死亡细胞和细胞碎片，折光度明显降低。药物处理24 h后DAPI染色显示，对照组细胞核较为完整，为椭圆形或圆形，染色质较为均匀，呈淡蓝色；TA组、CP组部分细胞核固缩，出现大小不同的核裂解碎片(凋亡小体)；而联合组多数细胞核固缩，细胞染色质聚集，部分细胞核边缘呈现不规则，染色较深，呈现蓝色荧光，出现更多的凋亡小体，表现出典型的细胞凋亡形态学变化，见图2。 2.3 TA与CDDP协同上调肝癌细胞ERS水平 药物处理24 h后，联合组细胞GRP78、GRP94 mRNA及蛋白的表达量明显高于TA、CDDP组(P<0.05)，见表3、图3。

表3 各组GRP78、GRP94 mRNA及蛋白水平比较组别GRP78mRNA蛋白GRP94mRNA蛋白对照组

1．00±1．000．80±0．101．00±1．000．70±0．00TA组

9．80±0．60ab1．20±0．20b2．50±0．20ab1．10±0．10abCDDP组3．00±0．20ab0．70±0．30b3．70±0．50ac1．20±0．10ab联合组24．70±4．10a2．20±0．50a7．10±0．70a1．50±0．10a a：P<0.01，与对照组比较；b：P<0.01，c：P<0.05，与联合组比较 图3 各组肝癌HepG2细胞GRP78和GRP94蛋白表达 3 讨 论

本研究发现TA与CDDP单独用药均能够抑制HepG2细胞的生长增殖，且均呈剂量性依赖；当使用二者IC50的一半浓度进行联合用药后，上述效应加剧，抑制率明显高于各单药组，表明TA与CDDP具有协同抗HepG2的作用。等效线图解法、CI、DRI，细胞及细胞核的形态学观察结果进一步证明了二者的协同作用。已有研究表明，药物产生的毒副作用主要与用药剂量密切相关，因此通过降低药物使用剂量能够降低其毒副作用[16]，TA与CDDP 的协同抑制HepG2细胞的作用，能够降低CDDP的使用剂量，减少其毒副作用，并且TA本身毒性较低，可作为CDDP的增敏药物，参与癌症的预防和治疗，作者认为TA具有潜在的临床应用价值。

当环境因素极大地扰乱内质网动态平衡的过程时，内质网将进行应激，并激活各种ERS反应。一方面，内质网会启动各种调节机制以减轻这些损伤，使细胞适应环境的胁迫，以促进细胞的存活；另一方面，如果细胞无法适应环境的胁迫，长时间的ERS将会引起细胞凋亡的发生[17-18]。GRP78和GRP94是内质网蛋白的分子伴侣，被认为是ERS的标志性分子。GRP78，即相对分子质量为78×103调节血糖的蛋白，也被称为ERS传感器结合免疫球蛋白(the immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)。GRP94是另一种主要的GRP，相对分子质量为94×103。在非ERS状态下，GRP78与蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、肌醇酶1α(IRE1α)、激活转录因子6(ATF6)形成稳定的配合物，并保持无活性状态[19]。GRP78通过阻止PERK和IRE1α二聚体的形成，来抑制其活性[19]；与ATF6结合阻断高尔基体定位信号，使ATF6稳定结合在内质网膜，阻止ATF6的进一步激活[20]。在ERS状态下，内质网中积累的错误折叠蛋白与GRP78蛋白竞争，使GRP78从PERK、IRE1α和ATF6 上解离，从而失去其抑制作用，引起下游相关信号转导[20]。

ERS介导的细胞凋亡与众多癌症的发生、发展等有关。癌细胞自身创造的低氧、

低pH值和低营养等不利的微环境都有助于引起ERS。但癌细胞能够通过多种方式去适应这种环境应激，以阻止ERS诱导的细胞凋亡相关信号途径[18]。当癌细胞无法适应环境的胁迫，持续的ERS将会诱导癌细胞凋亡的发生，如MESE等[21]研究发现GRP78表达上调能够使人表皮细胞癌A431细胞株对CDDP的敏感性增强。王涛等[22]研究发现GRP94表达上调能够增加肺癌细胞株NCI-H460对CDDP的敏感性。本研究显示，用药24 h后，TA、CDDP组与联合组GRP78和GRP94表达均有所上调，且联合组上调最高，表明ERS是TA和CDDP协同促进HepG2细胞凋亡的靶点之一。其机制可能是TA通过阻断蛋白质从内质网到高尔基体之间的运输，诱导HepG2细胞的ERS 水平升高，高水平的ERS通过激活PERK-ATF4、IRE1α-XBP1和ATF6信号通路来抑制细胞DNA修复酶的活性，从而协同性增加CDDP对癌细胞的DNA 损伤作用[23-25]，最后激活Caspase 蛋白家族级联反应[26]，诱导细胞凋亡的发生。然而，关于ERS 的PERK-ATF4、IRE1α-XBP1和ATF6 信号通路激活的具体分子机制有待进一步研究。 综上所述，TA和CDDP能够协同增强肝癌HepG2细胞的凋亡，其协同作用与ERS途径的激活有关，为TA与CDDP应用于临床治疗肝癌提供了理论基础。 参考文献

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