马兜铃酸

一、 立题依据

马兜铃酸－I (aristolochic acid，AA－I)是马兜铃属植物的主要成分，国内外都广泛使用马兜铃属植物入药，常用于抗风湿、利胆、利水和妇科疾病的治疗，如关木通、广防己、 青木香等。从20世纪60年代开始陆续有文献报道过量服用中药关木通(Aristolochia manshu-fiensis Kom，AMK)引起急性或慢性肾功能衰竭1，而关木通中的主要肾毒性物质是马兜铃酸－I，因此近年来马兜铃酸的肾毒性作用、致突变性和致癌性引起了国内外广泛的关注，其中肾毒性作用为研究热点。在本实验中，我们通过建立马兜铃酸－I肾损害大鼠模型，探究马兜铃酸－I对大鼠的慢性肾毒性反应，对于今后指导临床用药具有重要意义。

二、 实验原理

马兜铃酸－I具有毒性蓄积作用，其引起的相关性肾损害主要表现为肾小管间质病变，后期可导致间质纤维化的形成2。随着小管间质纤维化渐渐导致肾小球硬化、荒废，最后达到终末期尿毒症，这一过程急缓与马兜铃酸服用剂量明显有正相关。因此，按马兜铃酸－I使用剂量和服用时间的不同，马兜铃酸肾病（Aristolochic Acid Nephropathy,AAN）可分为 3种类型：

1. 急性马兜铃酸肾病

其为短期大剂量服用含马兜铃酸药物引起, 死亡率高。临床表现为少尿或非少尿性急性肾功能衰竭, 伴肾性糖尿及低渗透压尿, 尿酶升高, 尿常规显示蛋白尿伴少量红、白细胞及管型。且常有肾外表现, 如消化道症状表现恶心、 呕吐, 血液系统表现贫血、血小板减少, 肝功能损害及神经系统异常等。病理表现为急性肾小管坏死, 肾间质水肿。

急性肾功能的发病机制

肾缺血 肾中毒 血流动力学异常 肾小管损伤 滤过膜受损 皮质缺氧 髓质充血 肾小管阻塞 外髓部供氧 GRF 原尿反漏 滤过系数 少尿

2. 慢性马兜铃酸肾病

为持续小剂量服用含马兜铃酸药物引起, 也可由重症急性马兜铃酸肾病不愈发展而来。表现为首先出现夜尿多, 而后逐渐出现各种肾功能衰竭症状。尿化验常出现肾性糖尿, 低渗透压尿, 轻微蛋白尿, 少量红、 白细胞及管型, 肾功能呈进行性损害。后期出现氮质血症直至尿毒症, 常伴轻至中度高血压及贫血。B 超常发现肾脏体积缩小。病理表现为寡细胞性慢性肾间质纤维化, 肾小管萎缩或消失。 3. 肾小管功能障碍型马兜铃酸肾病

常发生在持续或间断小剂量服用数月后产生。表现为乏力、口渴、多饮、多尿、夜尿增多等, 肾小管酸中毒, Fanconi 综合征, 伴肾小管浓缩功能障碍, 尿渗透压降低。病理表现主要肾小管变性及萎缩3。

在本实验中，通过对四组大鼠用不同剂量的马兜铃酸－I灌胃培养，建立马兜铃酸－I慢

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性肾损害大鼠模型。在实验过程中，对大鼠尿液、血液及肾脏等相关各项指标进行检测、记录，以探究马兜铃酸－I慢性肾损害的作用机制。

三、 实验材料

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1.实验动物：雄性Wistar大鼠44只

2.实验药品：AA－I制剂（含量〉98%，中国药品生物制品检定所，批号110746-200204，

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以0.5 %羧甲基纤维素钠将其研磨成相应浓度的混悬液）、乙醚

3.实验仪器：离心机、血球自动分析仪、全自动生化分析仪、尿液分析仪、分析天平 4.其他：注射器、手术器械、1.5ml EP管、采血器具、棉球、平皿、生理盐水等

四、 实验步骤

1.适应性培养大鼠5d，称重，记录；

2.按照统计学方法，将大鼠随机分为4组：对照组（11只）、小剂量组5 mg/ (kg·d)（11只）、中剂量组15 mg/ (kg·d)（11只）、大剂量组30 mg/ (kg·d)（11只），AA-I以3 mg/ mL 为

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高剂量浓度等比稀释,大鼠按每100 g 体重灌胃给予受试药混悬液1 mL，1次/1d,连续20天； 3.每天对大鼠进行一般检查，每隔1天测量一次体重，记录数据； 4.15d给药后，在动物笼中收取24h尿，进行尿液检测；

5.16d时，各组取出1只大鼠做预实验，保留血液、尿液及大鼠双肾； 6.末次给药后，在动物笼中留取24h尿液，进行尿液检测； 7.20d时，剔除不正常大鼠，各组留取8只大鼠，进行试验； 8.用乙醚麻醉大鼠，仰卧位固定，剖开腹腔；

9.进行腹腔动脉取血，取血不足时，迅速打开胸腔，进行心尖取血，进行血液检查； 10.采血后，立即剥离双肾包膜取新鲜肾脏，进行肾脏检查。 一般检查：

每天观察大鼠一般状况：体重、皮毛颜色、精神状态、排泄量等； 尿液检查：

1.24h尿量采用量筒计量；

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2.采用尿液分析仪测量尿蛋白（PRO）和葡萄糖（GLU）。 血液检查：

１.将取得的血液分成两部分；

２.一部分血液加入肝素抗凝物质混匀后，在血球自动分析仪中，检测白细胞（WBC）、红蛋白（RBC）计数；

3.另一部分静置1h，在离心机3500r/m离心10min，静置30min，取上清，用全自动生化分

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析仪检测尿素氮(BUN) 、肌酐(Crea) 、尿酸(UA) 指标。 肾脏检查：

1.肉眼观察，光镜观察大鼠肾脏切片； 2.用分析天平称重；

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3.计算脏器系数（脏器重量/体重）。

五、 结果分析

1 大鼠体质量及状态变化

随着喂养时间延长，对照组大鼠体重稳定增长，而实验组大鼠体质量减轻，高剂量组大鼠体质量减轻的更加明显，此结果与之前报道的关木通能够减轻体质量相一致。在试验的后几天，实验组均出现精神萎靡，畏寒卷缩，活动度减少，竖毛，毛色干枯，甚至有些大鼠会死亡，且这种现象随着剂量上升呈加剧趋势。 2 大鼠尿量变化

与对照组比较，实验组前十天各组尿量均明显增多，差异有显著性,随着实验的进行，实验组大鼠的尿量由多至少，到第20天，尿量与正常的对照组比较无显著差异。提示马兜铃酸有利尿作用，但长期用药后，利尿作用减弱，而后逐渐出现各种肾功能衰竭症状。 3 尿液指标检测（尿葡萄糖（GLU)、尿蛋白（PRO))结果

尿液检测结果显示，比起对照组，实验组尿蛋白、尿葡萄糖指标均偏高，逐日增加，且具有剂量依赖性。提示马兜铃酸作用后，肾功能发生明显损害，肾小球滤过膜的分子屏障和电荷屏障功能降低，大量血浆蛋白，尤其白蛋白进入原尿，超过了肾小管的重吸收能力而产生大量蛋白尿。 4 血液指标检测结果

表现为红细胞数（RBC）下降，且与对照组比较具有统计学差异。这主要是由于机体贫血的程度与肾衰病情轻重程度平行。目前研究认为，随着肾组织破坏的加重，促红细胞生成素（EPO）的生成相对缺乏或不足，这是造成CRF机体贫血的重要因素之一。 5 肾功能指标检测结果(血尿素氮(BUN) 、肌酐(Crea) 、尿酸(UA))

与对照组相比，实验组血尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)增加，提示肾小球滤过功能减退。对照组大鼠的尿酸(UA)水平明显高于对照组。提示马兜铃酸重毒肾小球滤过率减低，尿酸不能由肾清除，导致尿酸排泄障碍，出现高尿酸血症。 6 肾脏大体标本观察和光镜检查

大体标本观察: 4组大鼠肾表面光滑,未见凹凸不平。3组马兜铃酸实验组肾皮质变薄,肾脏重量明显低于对照组，肾脏系数下降。

光 镜 观 察：对照组肾小球、小管结构清晰、形态正常，无异常病理表现；马兜铃酸实验组主要病理表现为寡细胞性慢性肾间质纤维化可见肾间质呈多灶或大片状纤维化，肾小管萎缩或消失，肾小球基底膜呈缺血性皱缩。

六、 结果讨论

马兜铃酸肾病是由于服用含马兜铃酸的中草药而导致的快速间质性纤维化，马兜铃酸本

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身具有肾脏毒性和致癌性。国内长期使用含马兜铃酸成分的中草药，因此阐明其对肾脏的

潜在毒性具有重要价值。

我们组通过持续小量给大鼠灌胃AA－I，建立了慢性的马兜铃酸肾病模型。实验可见，马兜铃酸-I的慢性肾毒性有以下特点：（1）表现为精神萎靡，畏寒卷缩，活动度减少，竖毛，毛色干枯，甚至有些大鼠会死亡。（2）尿量明显增多，各组间具有显著的差异性。随着实验的进行，尿量逐渐减少，最后于正常对照组持平。（3）尿葡萄糖、尿蛋白等尿液指标均偏高，逐日增加，且具有剂量依赖性。（4）红细胞数下降，机体出现贫血症状。（5）血尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、尿酸(UA)等肾功能指标增高，（6）肾脏皮质变薄，重量明显低于对照组，光镜下病理表现为寡细胞性慢性肾间质纤维化。

我们观察到在应用马兜铃酸后，短期内可导致大鼠增重缓慢，随着剂量增多及时间延长，体质量还有减轻的现象，尿量明显增多，这可能是马兜铃酸被用作利尿、减肥药的药理作用基础。尿量后期减少，出现尿葡萄糖、尿蛋白等含量增高，原因可能是马兜铃酸-I损伤肾小管造成肾小管功能障碍引起尿液浓缩能力下降，对原尿的重吸收减少，这与本实验中所得肾脏组织形态学检验结果相符合。血尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)增加，尿酸(UA)水平明显高于对照组。提示马兜铃酸中毒肾小球滤过率减低，尿酸不能由肾清除，导致尿酸排泄障碍，最后出现出现高尿酸血症。随着用药时间延长，肾脏病理也呈进行性加重趋势，后期小管结构紊乱严重，并出现严重的灶性萎缩及间质早期纤维化。随着对肾脏器官损伤的进行性加重，促红细胞生成素的相对缺乏，导致血液中红细胞数量减少，表明有一定程度贫血的存在，机体免疫力低下，这与试验所见的小鼠精神状态萎靡、活动减少、毛色干枯相符合。

综上所述，AA-I主要毒性器官在肾脏，除损伤肾小管外，对肾小球也造成严重损害，同时可引起全身性中毒性反应。这些毒性机制各不相同，有待于进一步研究。关木通、广防己、汉防已、马兜铃、青木香、寻风骨、铁线莲等中草药中含有丰富的马兜铃酸，因此在应用这些中草药时也须谨慎。为了保障人民用药安全, 我们应充分认识含马兜铃酸药物的潜在危害。纠正天然药物无毒或毒性小的偏见, 同时避免以偏概全, 对中草药肾毒性的认识扩大化。临床用药时应引起医生和患者的高度重视。

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