小鼠肺间质树突状细胞的分离_纯化与鉴定_王宏伟

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2011.09.012

#免疫学技术与方法#小鼠肺间质树突状细胞的分离、纯化与鉴定¹

王宏伟 陆江阳 田 光º 刘 茜 赵 敏 杨 毅 康佳蕊(总医院第一附属(304)医院病理科,北京100048)

中国图书分类号 R317 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2011)09-0814-05

[摘 要] 目的:建立肺间质树突状细胞(DCs)的分离与纯化方法,为肺间质DCs的相关研究提供实验基础。方法:雄性BALB/c小鼠肺组织经Ñ型胶原酶消化、密度梯度离心、CD11c+免疫磁珠分选纯化DCs,流式细胞术鉴定分选DCs纯度,倒置相差显微镜观察孵育细胞生长状态,扫描电镜和透射电镜观察DCs超微形态,流式细胞术检测肺间质DCs的CD11c、CD11b、CD86和I-Ab表型。结果:分选获得的肺间质DCs经鉴定,纯度为92.59%?5.62%,在RPMI10培养基中生长状态良好,少数细胞形成小细胞集落。DCs超微形态观察显示细胞表面多见长1~2Lm密集的树枝状突起,细胞器不发达,细胞核形不规则。90%以上肺间质DCs为未成熟状态或前体DCs,低表达成熟标志物I-Ab和CD86,并具有异质性,近40%起源于髓系细胞分化。结论:密度梯度离心和免疫磁珠分选是分离、纯化肺间质DCs的理想方法,获得的DCs纯度高、活性好、免疫表型稳定,但操作步骤比较复杂,技术要求高。

[关键词] 肺;树突状细胞;免疫磁珠;CD11c

Theseparation,purificationandidentificationofmouseinterstitialdendriticcellsinlung

WANGHong-Wei,LUJiang-Yang,TIANGuang,LIUQian,ZHAOMin,YANGYi,KANGJia-Rui.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofGeneralHospitalofPLA,Beijing100048,China

[Abstract] Objective:Toestablishthemethodstoseparateandpurifypulmonaryinterstitialdendriticcells(DCs)ofmiceinordertoprovideexperimentalbasefortherelatedstudyonthem.Methods:PulmonaryinterstitialDCsofmaleBALB/cmicewereseparatedbylungtis-suedigestinganddensitygradientcentrifugation,andwerepurifiedbyCD11c+microbeads.GrowthstateofDCswasobservedbyphasecontrastmicroscope.UltrastructureofDCswasobservedbyscanningandtransmissionelectronmicroscope.ImmunologicalphenotypeofDCswasana-lyzedwithCD11c,CD11b,CD86andI-Abbyflowcytometry.Results:ThepurityofpulmonaryDCsacquiredbyseparationwithimmunomagnet-icbeadswas92.59%?5.62%,andtheygrewingoodstateinculturemedia.DCshadcoarctatedendritcprocessof1-2Lminlengthinthesurface,incompleteorganelleincytoplasmandirregularnuclei.Over90%ofpulmonaryDCswereimmatureorpre-DCsexpressinglowlevelofmolecularmarkersI-AbandCD86,andtheywereheterogeneousabout40%ofthemoriginatingfrommyeloidcells.Conclusion:PulmonaryDCsacquiredbydensitygradientcentrifugationandimmunomagneticbeadshadhighpurityandstableimmunologicalphenotype.TheywererelativelypracticalmethodstoseparateandpurifypulmonaryDCsinspiteofcomplexprocedureandtechnique.

[Keywords] Lung;Dendriticcells;Immunomagneticbeads;CD11c

树突状细胞(Dendriticcells,DCs)是一类功能强大的专职抗原提呈细胞,在机体免疫应答和免疫调

¹本文为国家自然科学基金资助项目(81000848)º军事医学科学院微生物流行病研究所,北京100071

作者简介:王宏伟(1976年-),男,博士,副主任医师,主要从事血液

病理学及免疫病理学研究,E-mail:whw6626@sina.com;

通讯作者及指导教师:陆江阳(1957年-),男,硕士,主任医师,博士

生导师,主要从事创伤与危重病免疫病理学研究,E-mail:lujy@263.net。

控中起关键作用。DCs主要分布在免疫器官中,而分布于肺、肝、肾等非淋巴器官中的DCs被称作间质DCs。近年来的研究表明,肺间质DCs与肺感染、

哮喘、移植及创伤性免疫紊乱性疾病的发病机制密切相关,探讨DCs的免疫功能对阐明上述疾病的机制和防治具有重要意义。由于肺间质DCs数量稀少,分离、纯化难度大,了对其的深入研究。本文探讨小鼠肺间质DCs的分离、纯化和鉴定方法,为相关研究提供实验基础。

[1]

王宏伟等 小鼠肺间质树突状细胞的分离、纯化与鉴定 第9期#815#

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性BALB/c小鼠20只,6~8周龄,体重范围20?2克,购自军事医学科学院实验动物中心。实验前小鼠适应性标准食物喂养1周,自由饮水,实验前12小时禁食。将小鼠随机分为4组,每组5只。

1.2 肺低密度单个核细胞的制备 乙醚麻醉后,无菌摘取双侧肺,剪去周围多余软组织,4e的PBS液浸洗,浸入RPMI10培养基(HyClone公司)中,剪成直径1~2mm大小的碎块。RPMI10+5%的胎牛血清新鲜配制组织消化液,含Ñ型胶原酶(Worthing-ton公司)330U/ml和DNAaseÑ(Sigma公司)1mg/ml,肺组织块与消化液以1B30比例混合,37e水浴中消化60~90分钟,用毛细吸管每10分钟轻轻吹打一次,加入10mmol/LEDTA液终止消化过程。200目不锈钢网过滤组织碎片,1500r/min常温离心5分钟,去上清。4e含5%胎牛血清的HBSS(HyClone公司)液重悬细胞,吹打、洗涤。2ml冷PBS重悬细胞,先后将2ml密度1.075和1.030细胞分离液沿玻璃试管壁小心加入,最后将细胞悬液覆盖在分离液面表层,3000r/min常温离心15分钟。吸取两种密度分离液面间的白色絮状物,重悬于10ml含5%胎牛血清4e的PBS中洗涤。取少量细胞悬液,用毛细吸管滴加至APES胶片上,固定、脱水,常规HE染色,光学显微镜观察、照相。1.3 免疫磁珠分选肺DCs 肺单个核细胞重悬于10ml的RPMI10培养基中,37e孵育60分钟,收集细胞重悬于400Ll含0.5%BSA的PBS中并进行细胞计数。加入抗小鼠MACS-CD11c+microbeads,混匀后4e孵育30分钟;将MS分选柱(Miltenyi公司)放入磁场中,润洗分选柱,加入500Ll磁珠孵育的细胞悬液,待阴性细胞流出,缓冲液冲洗分选柱。将分选柱从磁场中拿出,加入1mlPBS用活塞将柱中细胞推入试管中。另取一个新的分选柱,重复分选操作。分选后细胞重悬于PBS中,调整细胞浓度至10/ml。按106的浓度接种于含10%的胎牛血清的RPMI10培养基中,37e、5%的CO2细胞培养箱中孵育60分钟,适时进行倒置相差显微镜观察并照相。

1.4 磁珠分选肺DCs的纯度和免疫表型的流式细胞术检测 将新鲜分选的肺DCs重悬于PBS中,常温静置10分钟。取100Ll细胞悬液稀释10倍,用血细胞计数板进行细胞计数。计数后用冷PBS调整细胞悬液至浓度1@105~106ml-1。将上述细胞悬液分装于流式管中,每管体积为200Ll,静置5分钟后加6

入荧光标记抗体:PE-CD11c、PE-IgGIsotypeControl、PE-CD86、FITC--IAb、FITC-CD11b(BD公司)。4e孵育30分钟,用冷PBS洗涤1次。重悬细胞后立即进行流式检测,用FlowJo软件进行检测数据分析。

1.5 扫描电镜观察 将新鲜分离纯化的肺DCs重悬于0.1mol/LPBS中制成悬液,1000r/min离心10分钟,洗涤2次。将50Ll细胞悬液滴加在多聚赖氨酸包被的载玻片上,室温静置10分钟,细胞自然沉降在载玻片上。生理盐水洗涤载玻片3次,立即置于215%的戊二醛(pH7.2~7.4)中4e固定1小时。011mol/LPBS漂洗2次,每次30分钟。1%锇酸固定1小时。常规脱水、干燥、镀膜。扫描电镜观察并照相。1.6 透射电镜观察 将分离纯化的肺DCs重悬于Effendorf管中,1000r/min离心5分钟,吸去上清,加入10%BSA0.1ml,室温静置20分钟,1000r/min离心5分钟,弃上清,取出细胞凝块,切成直径约1mm的小块,置于3%的戊二醛溶液中,预固定24小时,OsO4后固定2小时,梯度脱水、包埋、超薄切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色,置于铜网上。JEM-1200EX型透射电镜观察并照相。

2 结果

2.1 肺低密度单个核细胞的形态学观察 肺组织经Ñ型胶原酶消化和密度梯度离心,悬浮在两种密度分离液中间的云雾状细胞即为肺低密度单个核细胞,经HE染色后光镜观察:细胞散在分布,体积中等偏小,圆形或卵圆形,胞浆呈弱嗜酸性,部分细胞胞膜见纤细突起,细胞核居中或偏位,核仁不明显,少数细胞可见分叶状核(图1)。

2.2 磁珠分选肺DCs的纯度鉴定 肺低密度单个核细胞经CD11c+免疫磁珠吸附并利用MS柱阳性分选肺DCs。分选后纯化细胞与对应的MS柱滤过细

图1 肺低密度单个核细胞涂片(HE,@400)

Fig.1 Lunglowdensitymononuclearcellssmear(HE,@400)

#816#中国免疫学杂志2011年第27卷

胞悬液利用PE-CD11c进行DCs纯度的流式细胞术,检测显示分选细胞与滤过细胞悬液CD11c荧光强度形成明显的峰位移动,CD11c+DCs占阳性分选细胞总数的92.59%?5.62%,磁珠分选DCs达到较高的纯度。

2.3 DCs生长状态倒置相差显微镜观察 磁珠分选的肺DCs接种于RPMI10培养基中,倒置相差显微镜观察细胞的生长状态。DCs悬浮生长,轻微晃动培养皿,细胞随液体浮动,未见贴壁生长细胞。多数细胞单个均匀分布,少数形成细小集落。细胞体积较小,卵圆形,大小均匀一致,细胞表面可见微小的突起,呈树枝状,细胞界限清晰,折光性强,生长状态良好(图3)。

2.4 DCs超微形态扫描电镜观察 扫描电镜观察,DCs单个细胞分布,细胞呈圆球体形,直径8~10Lm。细胞表面布满细密清晰的皱褶,凸凹不平,多见密集的长1~2Lm的表面树枝状突起,边界电子密度反差明显(图4)。

2.5 DCs超微形态透射电镜观察 透射电镜观察,细胞核呈多角状或类圆形,体积中等大小,细胞胞质可见清晰密集的树枝状突起,突起盲端钝圆呈指状。细胞器不发达,胞质电子致密度较低,有少量糖原颗

粒、高尔基复合体及线粒体分布,胞浆中未见各级溶酶体和吞噬颗粒,缺乏张力微丝及细胞连接结构。核

图3 DCs的生长状态(倒置相差显微镜像,@1000)

Fig.3 ThegrowthstateofDCs(Imageofphasecontrastm-i

croscope,@1000)

图2 分选肺DCs纯度流式检测结果峰图

Fig.2 FlowcytometrygraphofpurityanalysisofsortedpulmonaryDCs

Note:FlowcytometrygraphofpulmonaryDCssortedbyimmunomagneticbeads:theleftisfilteredfluid,themiddleissortedfluid,therightisdouble-humpedgraph

ofthem.

图4 DCs表面超微形态扫描电镜像(@12.0K)

Fig.4 DCsimageofscanningelectronmicroscope(@12.0K)图5 DCs超微形态透射电镜像(@20.0K)

Fig.5 DCsimageoftransmissionelectronmicroscopy(@20.0K)

王宏伟等 小鼠肺间质树突状细胞的分离、纯化与鉴定 第9期#817#

图6 磁珠分选肺DCs流式检测结果峰图

Fig.6 FlowcytometrygraphofpulmonaryDCssortedbyimmunomagneticbeads

膜表面见凹陷形成,细小的异染色质颗粒沿核膜稀疏分布,胞核可见核仁(图5)。

2.6 磁珠分选肺DCs的流式细胞术检测 流式检测峰图显示(图6),分选纯化肺DCs表达髓系标志物CD11b(即髓系DCs)占DCs总数的39.59%,表达抗原提呈分子MHC-II/I-Ab的DCs比例为8.97%,表达诱导特异性免疫应答共刺激分子CD86的DCs比例为3.16%。

疫功能对深入研究上述疾病的机制和防治具有重要意义,近几年已经引起国内、外相关研究的广泛关注。

目前,肺间质DCs研究的难点主要表现以下几个方面:(1)肺间质DCs数量十分稀少,占肺实质细胞总数的不足1%,获得研究所需的细胞数量和质量难度较大;(2)DCs亚群标记复杂。DCs是机体一大类免疫细胞,由于发育阶段、成熟度、免疫功能的不同,它们分为多种起源和不同成熟状态的亚群,因此需要多种表面分子的共同标记才能对DCs的分化阶段和亚群进行准确区分,达到科学研究的准确性和可靠性;(3)肺间质富含纤维和基质成分,DCs分布于肺间质相对致密的支架中,较脾脏、淋巴结和肝脏等富于实质细胞的脏器分离技术环节多、难度大、稳定性差;(4)从富含多种细胞成分的细胞悬液中分离纯化肺DCs需要专门的免疫磁珠吸附与富集,免疫磁珠价格昂贵,花费较大。

本文在国内首次应用密度梯度离心和免疫磁珠技术分离和纯化肺间质DCs,达到了比较理想的效果。在本研究中Ñ型胶原酶处理过的肺组织单细胞悬液通过密度梯度离心制备成肺低密度单个核细胞,去除了肺泡上皮细胞、肺间质细胞、血管内皮细胞等,从而获得了包括DCs、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等在内的低密度单个核细胞,继续通过CD11c+磁珠的免疫磁性吸附和洗脱,有效地纯化富集了CD11c+DCs,并进一步去除了淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞等其它混杂成分。经流式细胞术鉴定,分选的CD11c+DCs达到了较高的纯度。经磁珠分选纯化的肺DCs生长状态良好,部分形成分散的细胞集落,超微形态学特征明显。分选后流式检测结果显示,肺DCs高表达髓系标志物CD11b,即分选细胞中近40%为髓系DCs,表明肺DCs具有异质性,较大部分起源于髓系造血细胞。低表达抗

(下转第831页)3 讨论

DCs是一类具有强大抗原提呈能力的专职抗原

提呈细胞(APC),能捕获、加工抗原,将抗原信息提呈给初始型T细胞,诱导T细胞增殖,激活特异性免疫应答反应,是连接天然性和特异性免疫的桥梁,同时具有重要的免疫调节作用[2]。DCs起源于骨髓造血干细胞,分化为前体DCs,进入外周血,但数量稀少,仅占外周血细胞总数的1%~2%,随血液循环广泛分布于机体的组织器官。早期研究认为,DCs只存在于淋巴结、脾脏和胸腺等淋巴器官中,近年来经流式细胞学和细胞分离培养技术证明,肺、肝、肾、心、胃肠道和皮肤等非淋巴组织中均存在DCs,它们被称作间质DCs[3,4]。

肺是机体与外界环境进行气体交换获取氧气的场所,它对外界环境开放,同时也是细菌、病毒、异物等有害抗原进入机体的主要入口,因此,高级哺乳动物肺具有一个结构和功能完善的免疫微环境,抵御外界有害抗原入侵,又可以对无害抗原产生免疫耐受,免受不必要的损伤。肺间质DCs是肺免疫微环境中重要的抗原提呈和免疫调节细胞,发挥免疫前哨监视和诱导特异性免疫应答反应的功能[5,6]。作为肺免疫微环境中的重要组成部分,肺间质DCs与肺部细菌、病毒和寄生虫感染、哮喘、移植、创伤性免疫紊乱等疾病的发病机制密切相关[7,8]

,探讨DCs免高丽霞等 狼疮肾炎中Th17细胞相关细胞因子的变化 第9期6 KotakeS,UdagawaN,TakahashiNetal.IL-17insynovialfluidsfrom

patientswithrheumatoidarthritisisapotentstimulatorofosteoclastogenesis[J].JClinInvest,1999;103:1345-1352.

7 KurasawaK,HiroseK,SanoHetal.Increasedinterleukin-17production

inpatientswithsystemicsclerosis[J].ArthritisRheum,2000;43:2455-2463.

8 FerraccioliG,RomanoG.Renalinterstitialcells,proteinuriaandprogres-sionoflupusnephritis:newfrontiersforoldfactors[J].Lupus,2008;17:533-0.

9 HammadAM,YoussefHM,E-lArmanMM.Transforminggrowthfactor

beta1inchildrenwithsystemiclupuserythematosus:apossiblerelationwithclinicalpresentationoflupusnephritis[J].Lupus,2006;15:608-612.

10 OhtsukaK,GrayJD,StimmlerMMetal.Therelationshipbetweende-fectsinlymphocyteproductionoftransforminggrowthfactor-beta1insys-temiclupuserythematosusanddiseaseactivityorseverity[J].Lupus,1999;8:90-94.

11 AringerM,SmolenJS.Cytokineexpressioninlupuskidneys[J].Lupus,

2005;14:13-18.

12 SabryA,SheashaaH,E-lHusseiniAetal.Proinflammatorycytokines

#831#

(TNF-alphaandIL-6)inEgyptianpatientswithSLE:itscorrelationwithdiseaseactivity[J].Cytokine,2006;35:148-153.

13 DongG,YeR,ShiWetal.IL-17inducesautoantibodyoverproduction

andperipheralbloodmononuclearcelloverexpressionofIL-6inlupusnephritispatients[J].ChinMedJ(Engl),2003;116:3-8.14 CastellaniML,AnogeianakiA,FelacoPetal.IL-35,anant-iinflamma-torycytokinewhichexpandsCD4+CD25+Tregcells[J].JBiolRegulHomeostAgents,2010;24:131-135.

15 NguyenCQ,HuMH,LiYetal.Salivaryglandtissueexpressionofin-terleukin-23andinterleukin-17insjogren.ssyndrome:findingsinhu-mansandmice[J].ArthritisRheum,2008;8:734-743.

16 KomuraKFujimotoM,HasegawaMetal.Increasedseruminterleukin

23inpatientswithsystemicsclerosis[J].JRheumatol,2008;35:120-125.

17 YoshidaH,YoshiyukiM.Regulationofimmuneresponsesbyinterleukin-27[J].ImmunolRev,2008;226:234-247.

[收稿2010-10-21 修回2011-04-11]

(编辑 倪 鹏)

(上接第817页)

原提呈分子MHC-II/I-Ab和共刺激分子CD86,表明肺DCs绝大部分为未成熟DCs或前体DCs,在未受抗原刺激的情况下诱导特异性免疫应答能力低下。

为提高分离纯化肺间质DCs的质量,本研究表明以下几个环节较为关键:(1)严格掌握消化肺组织胶原酶的浓度和时间是提高DCs纯度和生物活性的前提;(2)密度梯度离心是分离肺单个核细胞的关键步骤,合适的密度梯度和体积配比是提高分离效果的重要保证;(3)分离的肺间质DCs是不贴壁悬浮细胞,利用此特性可以去除贴壁的巨噬细胞等混杂成分,进一步提高DCs的纯度;(4)肺间质DCs在体外缺乏特异细胞因子的情况下难以长期存活,应避免细胞体外自发凋亡和死亡对实验结果的干扰和影响。

2009;227(1):234-247.

3 NautaAJ,KruisselbrinkAB.Mesenchymalstemcellsinhibitgeneration

andfunctionofbothCD34+-derivedandmonocyte-deriveddendriticcells[J].JImmunol,2006;177(4):2080-2087.

4 YoneyamaH,MatsunoK,ZhangYetal.Regulationbychemokinesofcir-culatingdendriticcellprecursors,andtheformationofportaltractassociat-edlymphoidtissue,inagranulomatousliverdisease[J].JExpMed,2001;193(1):35-49.

5 DonaldNC,KimB.Innateimmunecontrolofpulmonarydendriticcell

trafficking[J].ProcAmThoracSoc,2007;4(3):234-239.

6 IngelKD,KenRB,TaniaMetal.Differentrolesforhumanlungden-driticcellsubsetsinpulmonaryimmunedefensemechanisms[J].AmJRespirCellMolBiol,2006;35(4):387-393.

7 HaitaoW,CoryMH,JackGetal.Severesepsisexacerbatescel-lmediat-edimmunityinthelungduetoanaltereddendriticcellcytokineprofile[J].AmJPathol,2006;168(6):1940-1950.

8 LiChen,MeenakshiA,ManoharY.Distinctresponsesoflungandspleen

dendriticcellstotheTLR9agonistCpGoligodeoxynucleotide[J].JIm-munol,2006;177(4):2373-2383.

4 参考文献

1 UenoH,KlechevskyE,MoritaRetal.Dendriticcellsubsetsinhealthand

disease[J].ImmunologicalReviews,2007;219(1):118-142.

2 JoffreO,NolteMA,SpirriRetal.Inflammatorysignalsindendriticcell

activationandtheinductionofadaptiveimmunity[J].ImmunolRev,

[收稿2010-12-24 修回2011-04-27]

(编辑 倪 鹏)