基因表达与信号转导课程论文

进步

Vinay Kumar and Mukesh Jain*

摘要

基因编辑是指对基因组中的一段特异的靶DNA序列，通过碱基的增添、删除或者替代，从而改变这段DNA序列的一种技术。人工设计的核酸酶，锌指核酸酶(zinc-finger nucleases ,ZFNs),转录因子样效应核酸酶(transcription activator–like effector nucleases,TALENS)以及CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated protein)系统这三种基因编辑工具在多种物种中被广泛应用，其中包括植物。近来发展起来的CRISPR/Cas系统与ZFNs、TALENs相比，看似效率更高，并且消耗的时间更短。该系统运用一个RNA介导的核酸内切酶Cas9，使DNA产生双链断裂(double-strand break,DSB)。Cas9作用产生的双链断裂，通过细胞内的DNA修复机制—同源重组或者非同源末端的连接进行修复，在此过程中极易产生基因突变，从而达到基因修饰的目的。在这篇文章中，我们对CRISPR/Cas系统进行了全面详细的介绍，以及它在不同生物体特别是植物中的应用。最近的调查显示CRISPR/Cas系统最为一种非常有前景的基因编辑工具，在植物的定点基因修饰中被广泛应用。相信在不久的将来，CRISPR/Cas系统在植物功能基因的研究中会得到研究者更多的青睐，并且对提高作物的产量也会有极大的帮助。

关键词：CRISPR/Cas9系统，基因编辑，CRISPRi，脱靶

The CRISPR–Cas system for plant genome editing: advances and

opportunities

Vinay Kumar and Mukesh Jain*

Abstract

Genome editing is an approach in which a specific target DNA sequence of the genome is altered by adding, removing,or replacing DNA bases. Artificially engineered hybrid enzymes, zinc-finger nucleases (ZFNs), and transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)–Cas (CRISPR-associated protein) system are being used for genome editing in various organisms including plants. The CRISPR–Cas system has been developed most recently and seems to be more efficient and less time-consuming compared with ZFNs or TALENs. This system employs an RNA-guided nuclease, Cas9, to induce double-strand breaks. The Cas9-mediated breaks are repaired by cellular DNA repair mechanisms and mediate gene/genome modifications. Here, we provide a detailed overview of the

CRISPR–Cas system and its adoption in different organisms, especially plants, for various applications. Important considerations and future opportunities for deployment of the CRISPR–Cas system in plants for numerous applications are also discussed. Recent investigations have revealed the implications of the CRISPR–Cas system as a promising tool for targeted genetic modifications in plants.This technology is likely to be more commonly adopted in plant functional genomics studies and crop improvement in the near future.

Key words: CRISPR/Cas9 system, genome editing, CRISPRi,off-target

1.引言：

基因的定点编辑作为一种先进的技术，可以对细胞生物基因组DNA进行高效率、高精确度的修饰。这种方法通过控制细胞内的DNA修复系统来对靶DNA序列进行修饰。在这种方法里，通过人工合成核酸内切酶作用于基因组的靶位点，使其DNA双链断裂(double-strand break ，DSB)。要么在通过非同源末端重组精确修复DSB的过程中产生突变，要么插入一个donorDNA,通过同源重组的方式产生基因突变。近来在包括植物在内的多种生物中，这些人工合成的核酸内切酶越来越被广泛地应用于基因定点编辑技术中。

在这些人工合成的核酸酶中，一种内源性的核酸内切酶/大范围核酸酶meganuclease是第一个以基因编辑为目的应用于植物(拟南芥/玉米)中的核酸酶。[1]

酵母的核酸内切酶I-SceI以及它的同源蛋白是诱导DSB(double-strand break)修复机制的最主要的内源性核酸内切酶。[2]内源性核酸内切酶的DNA结合域、核酸酶的切割结构域互相重叠，因此很难设计不同的内源性核酸内切酶来作用于不同的靶位点。[2]除此之外，内源性核酸内切酶的识别位点在植物基因组中并不是天然存在的。对这些酶的合成及复杂组装致使它们作为一种植物基因编辑工具，其适用范围比较局限。

于是，科研工作者设计了由DNA结合域和核酸酶结构域组成的混合蛋白用于基因编辑。ZFNs以及TALENs是应用最广泛的用于基因编辑的混合蛋白，它们已经被用于多种不同的生物中。[3-5]ZFNs是由用于结合DNA的锌指蛋白组以及切割DNA的FokI核酸内切酶构成的。一个单一的ZFN单元包含三到四个结合DNA的锌指蛋白，每一个锌指蛋白识别一个三联体密码。两个ZFNs(两者相距5-6bp)就可以识别一段大约18-24bp 的特异DNA序列，并且当两个ZFNs相距合适的距离时，FokI核酸内切酶的两个单体二聚化，激活其切割活性，使DNA双链断裂，产生DSB(double-strand break)。ZFNs在拟南芥、烟草、玉米、大豆等多种植物的基因打靶中都得到了广泛应用，产生了许多可遗传的突变体。[6-7]

氨基酸残基和靶DNA序列相互作用的复杂性，使多个锌指模块的设计和组装十分困难。当然对锌指模块的每一个氨基酸残基和靶序列的每一个碱基对的相互作用的深入了解可以促进锌指模块的精确设计。此外，由于锌指模块对DNA的非特异性识别切割造成的脱靶现象也已经有相关报道。[8]再者，ZFNs在植物中的应用也受限于高昂的专利许可费，Sangamo生物公司垄断了ZFNs的专利权。

TALENs是由植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的激活因子样效应物蛋白(TALE蛋白)组装成的DNA识别区和FokI核酸内切酶结构域构成的。TELAs是由多个33到34个氨基酸可变重复模块构成的。每一个重复模块中的第12、13位的氨基酸可以特异性地识别核苷酸碱基，通过组装不同的模块就可以特异性识别一段DNA序列。由于TALENs的识别区域比ZFNs要长一些，所以其脱靶率要比ZFNs低一些。TALENs作为新型的、有效的基因打靶工具在多种植物(短柄草、水稻、烟草、小麦等)中被报道。[9-11]然而，TALEs蛋白的模块组装过程复杂，是一项具有挑战性的工作。现在科研工作者已经研发了很多方法来促进重复模块的组装，以及利用各种电脑程序对TALEs蛋白进行有效的设计和靶位点的预测。[11-13]而且现在已经有关于哺乳动物系统的TALES数据库，相信不久肯定也会有关于植物系统的TALES数据库。但是这项技术针对不同的DNA靶序列需要对结合DNA的蛋白进行复杂的设计和组装，这将是一项十分繁重的工作。

近来，一种基于细菌的获得性免疫系统CRISPR/CasⅡ型系统进行设计的高

效的基因编辑工具越来越受到科研工作者的青睐，并且已经应用到包括植物在内的多种生物中。CRISPR/Cas系统的主要构件有Cas蛋白和CRISPR RNAs。其中目前应用的Cas蛋白主要是Cas9核酸内切酶以及它的突变体，在两个小RNA，CRISPR RNA(crRNA),反式CRISPR RNA(tracrRNA)的帮助下，在特异位点切割DNA分子。以这两个RNA分子为模型可以人工合成一个嵌合RNA，称之为single guide RNA，sgRNA。[14]通过结合Cas9蛋白，sgRNA可以形成一个RNA介导的核酸内切酶，可以在基因组中进行特异性切割。sgRNA—Cas9蛋白复合体的位点特异性催化效率主要取决于sgRNA大约20bp的连续核苷酸序列(Fig. 1)。与ZFNs、TALENs相比，仅有20bp的sgRNA的合成要容易简单得多。

这篇文章中，我们首次对细菌和古菌中的CRISPR/Cas系统的类型和功能进行了概述，重点突出CRISPR/Cas9技术在基因编辑中的运用，并且介绍了它在其他方面的应用。同时我们也说明了一些解决CRISPR/Cas9技术脱靶问题的先进方法。最后我们简短地陈述了这项技术在不久的未来对提高作物产量可能有所帮助。

2.细菌和古菌中的CRISPR/Cas系统

很久之前，在细菌和古菌的基因组中就已经发现了许多简短的不连续的重复序列(CRISPR位点)。三家的研究结构分别报道了CRISPR序列中的高度可变间隔序列与病毒的基因组、质粒序列高度同源。[15-17]这些报道认为细菌和古菌在抵御外源基因组的入侵过程中获得免疫能力，这其中，CRSPR序列和Cas蛋白扮演了重要的角色。近来，由于CRSPR/Cas系统可以切割降解外源入侵的DNA序列这一特性，被开发利用为一种新型的基因编辑工具。CRSPR/Cas系统主要存在于大部分古菌(90%)和细菌(48%)基因组中。大部分细菌和古菌的基因组中只包含一个CRSPR/Cas系统，少数例外情况下，可能包含不止一个CRSPR/Cas系统。这个系统可以在基因组CRISPR序列的特异位点处插入一小段外源间隔序列。带有间隔序列的CRISPR序列，以及各种Cas蛋白的基因在基因组中处于相邻的位置，这对CRISPR/Cas系统作为细菌的获得性免疫系统在抵御外源DNA的入侵过程中发挥作用显得十分必要。[18]

CRSPR/Cas系统作用的靶点是入侵病原菌的DNA或RNA。多种多样的Cas蛋白具有RNA酶和DNA酶活性，在CRSPR/Cas系统发挥作用过程中扮演着重要的角色。Cas1和Cas2在所有的CRSPR/Cas系统中均存在，其中Cas1蛋白是一个非特异性、金属离子依赖型的DNA酶，而且和间隔序列插入到CRISPR位点有关；Cas2蛋白也是金属离子依赖型的核酸内切酶，但是它所扮演的角色现在还不清楚。Cas3蛋白有一个HD结构域，具有金属离子依赖型核酸酶活性，可以作用于双链的寡核苷酸片段。Cas4是一个类似于RecB的核酸酶，主要与间隔序列的获得有关。Cas5和Cas6蛋白被命名为RAMPs超家族，至少包括一个RNA识别基序，以及一个富含甘氨酸的环状结构。 2.1CRSPR/Cas系统的分类

根据Cas蛋白的不同，将CRSPR/Cas系统分为三大类，类型Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。三种类型的CRSPR/Cas系统都有Cas1和Cas2。然而，结合crRNA和引发切割的效应复合物，在不同类型的CRSPR/Cas系统中是不同的。类型Ⅰ的CRSPR/Cas系统存在于细菌和古菌中，结合切割靶定DNA序列是利用Cas3蛋白的核酸内切酶活性。类型Ⅱ的CRSPR/Cas系统只在细菌中有所报道。除了Cas1和Cas2以外，该系统还以Cas9作为标签蛋白。Cas9是一个多功能蛋白，可以对crRNA前体进行加工形成成熟的crRNA，同时也可以在特定位点切割DNA。DNA 切

割过程中tracrRNA的参与以及原间隔序列邻近基序(PAM元件)的存在是Ⅱ型系统的显著特征。Ⅱ型系统是最简单的系统，并且只有四个Cas蛋白(Cas1，Cas2，Cas9，以及Cas4/Csn2)参与其中。类型Ⅲ系统的Cas蛋白除了RAMPs外，还有Cas10蛋白参与其中。Cas10蛋白参与crRNA的加工以及靶位点DNA的切割。Cas6以及其他的RAMP蛋白也参与crRNA的加工过程。这类系统主要存在于古菌中，但在一些细菌中也曾观察到。总之，这些研究结果揭示了细菌和古菌中CRSPR/Cas系统功能和机制的多样性。 2.2CRISPR/Cas系统的作用机制

细菌长期生活在充满噬菌体或者其它病原菌的自然环境中，进化出了多种防御系统，CRISPR/Cas 系统就是其中之一，比较常见的是Ⅱ型CRISPR/Cas系统 。当噬菌体入侵时，其基因组上的原间隔序列插入到宿主细胞CRSIPR序列的前导序列之后，作为第一个间隔序列；当该噬菌体 再次入侵时，细菌的CRISPR 序列转录产生一条长链RNA，即crRNA前体，随后Cas蛋白复合体在tracrRNA的协助下剪切产生成熟的crRNAs,最后tracrRNA-crRNA-Cas9复合体识别并切割与crRNA互补的外源DNA位点。整个过程大体上可以分为三个阶段：第一阶段，噬菌体DNA被识别，Cas蛋白复合物靶向裂解外源DNA的原间隔序列，该DNA的一个片段(20bp)作为新的间隔序列插入到宿主细胞的CRISPR序列，通常是在富含AT的CRISPR前导序列之后，从而使菌体拥有“记忆 ”，防御同一病毒的二次入侵；第二阶段 CRISPR序列转录产生长链crRNA前体，通常情况下由Cas蛋白复合物在 tracrRNA 帮助下，对crRNA进行加工处理，切割形成成熟的crRNA。每个crRNA都包含一个由插入的外源DNA片段转录而来的区域；第三阶段，crRNA-tracrRNA-Cas9形成复合物，crRNA识别靶序列上相应的互补序列，该序列3＇端往往存在PAM元件（ＮＧＧ），引导Cas9蛋白对靶序列进行切割。(Fig.2)

现在已经在多种生物中运用Ⅱ型CRISPR/Cas系统进行基因编辑。CRISPR/Cas9系统的设计和结构比较明了，成本低廉，并且没有知识产权的。CRISPR/Cas系统的组成成分，crRNA和tracrRNA复合体可以被编辑成一个sgRNA来引导Cas9切割产生特异位点的DNA双链断裂(Jinek et al., 2012)。由于sgRNA的设计也十分简单，所以CRISPR/Cas系统在基因编辑领域备受关注。起初，Ⅱ型CRISPR/Cas系统仅用于在体外对靶序列进行切割；最近，CRISPR/Cas基因编辑技术，已经成功应用到细菌、酵母以及其它生物的靶向突变中。研究表明CRISPR/Cas9系统在体内的靶向突变效率与ZFNs、TALENs的效率差不多。[19]

3.CRISPR/Cas系统的应用

CRISPR/Cas9系统已经在多种生物中得到广泛应用。例如，点突变的引入；基因功能的修饰；导入外源基因进行基因敲除；将靶蛋白运输到其作用的靶位点、抑制或者激活基因的表达以及表观遗传学修饰等。 3.1作为一种新型基因编辑工具

至今为止报道过的关于CRISPR/Cas9系统介导的植物基因的编辑并不是特别多。2013年，三个不同的研究机构同时报道了CRISPR/Cas9系统在植物基因定点编辑中的应用。[20-21]随后不久，又有报道表明CRISPR/Cas9技术作为新型基因编辑工具可以在模式植物和作物中得以应用。[22-23]

Cas9蛋白有许多突变体，包括Cas9蛋白、Cas9切口酶(Cas9 nickase)以及核酸酶缺陷型Cas9蛋白(nuclease-deficient Cas9，dCas9)等，有着不同的应用。野生型

人源化的Cas9(Wild-type humanized Cas9，hCas9)被成功应用到哺乳动物细胞基因敲除中。hCas9在特定的靶序列位点切割产生DNA双链断链，激活了DNA的修复机制—非同源末端连接(NHEJ)。在修复过程中在断裂的缺口处发生碱基的随机插入或者丢失，从而引起突变。据有关报道，经过设计的CRISPR/hCas9系统在人类细胞中的打靶效率要比TALENs高。并且，已经证实 CRISPR/hCas9系统可以同时编辑多个作用靶点。然而，hCas9由于具有毒性等一些负面效应，使其在基因组重排中的应用受到。在植物中，Shan et al. (2013b)运用订制的sgRNAs以及密码子优化的化脓性链球菌Cas9蛋白(SpCas9)在水稻和普通小麦中进行靶向基因修饰，得到了定向突变的植物体。[21]另一篇报道表明在模式植物拟南芥和烟草中，利用CRISPR/Cas9技术对八氢番茄红素脱氢酶基因进行靶向突变，并且精确统计了其基因突变率，分别是2.7%和4.8%。[20]Feng et al. (2013) 介绍了在拟南芥、水稻中，针对不同的靶基因,Cas9和sgRNA的表达组件。[23]并且发现了不论基因结构和染色质状态有何不同，靶基因都有很高的突变率。用一个

CRISPR/Cas9系统，其中包含两个sgRNA表达组件实现了对拟南芥基因组两个位点的同时靶向突变，这说明在植物中也可以利用CRISPR/Cas9系统对多个基因同时进行编辑。[24]近来，CRISPR/Cas9技术被成功用于在六倍体小麦中选择性靶向突变白粉病抗性基因的三个同源位点中的一个。更进一步地说，利用

CRISPR/Cas9系统对特异的、同源靶基因的编辑，有望可以提高转基因作物的产量。

hCas9 nicknase，hCas9核酸酶的突变体，在特异DNA序列的增添以及基因替换等方面应用广泛。hCas9 nicknase在作用于特异的靶DNA序列时，切割靶序列，只使其一条链断裂。通过促使DNA主要通过同源重组来进行修复，这样可以降低脱靶率。The CRISPR–hCas9 nickase系统已经在果蝇和小鼠中得以应用，并且靶向多个基因的效率高，脱靶率很低。在植物中，有报道说明可以通过向烟草的原生质体中导入一个双链的donorDNA， 使基因在进行同源重组修复时发生基因替换。总之，以上所有的研究例证表明CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑方面是一种新型的、有潜力的高效工具。

3.2CRISPR/Cas9系统的其它应用(除基因编辑外)

除了基因编辑外，CRISPR/Cas系统还可以用于调节基因表达。最近用于基因沉默的CRISPR干扰技术(CRISPRi)已经发展起来。相比RNAi，CRISPRi为基因沉默提供了更好的方法。选择目的基因，来设计sgRNA，使sgRNA与dCas9蛋白共表达。dCas9-sgRNA复合物与非模板DNA链的编码区相结合来阻止转录延伸的进程，从而达到沉默该基因的效果。这种方法同样可以用于阻止顺式作用元件DNA基序与反式作用元件转录因子在启动子区的结合，从而使转录停止在起始阶段。CRISPRi介导的基因敲除具有更高的特异性以及可逆性。与RNAi相比，CRISPRi的一个优势是它可以同时作用于多个靶基因。因此，CRISPRi在基因沉默方面表现了它更大的发展空间。除此之外，没有活性的Cas9蛋白可以和阻遏蛋白、激活蛋白相互结合，在特异的基因位点来招募更多的效应蛋白，抑制或是激活基因的表达。Krüppel-associated box，一个转录抑制子，在HEK293T细胞中与失活的Cas9蛋白结合后，比只有失活的Cas9蛋白作用于靶位点时抑制效率更高。相反地，在Escherichia coli中，RNA聚合酶的ω亚基和失活的Cas9蛋白结合后激活了基因的表达。[25]

近来，利用无活性的Cas9蛋白，结合一个增强的绿色荧光蛋白，再加一个特异性的sgRNA，这样就可以增强在靶位点的绿色荧光蛋白信号。这表明在基因组

分变化的可视化研究中，CRISPR/Cas9 系统为其提供了一个灵活的、强有力的

[26]

平台。最近又有研究者发现可以利用 CRISPR/Cas系统来纯化染色质的一个特异性组分，并且发现了与其相关的蛋白，阐释了它们在转录过程中的作用机理。[27]

这些报道都表明CRISPR/Cas系统作为一种新型的分子水平的工具将会有更广阔的应用前景。

4.CRISPR/Cas系统的脱靶问题

为了提高CRISPR/Cas系统的作用效率以及特异性，分析它可能的脱靶问题是十分必要的。任何基因打靶工具都存在脱靶问题，当然CRISPR/Cas系统也不例外。据有关报道，我们已经了解到CRISPR/Cas系统作用于人类细胞时，脱靶率较高，而在小鼠和斑马鱼中脱靶效率要低一些。而通过PCR和再测序发现在植物中同样存在脱靶的问题。那么，如何才能尽量降低CRISPR/Cas系统的脱靶率呢？有许多科研工作者已经开始了这方面的研究。大部分的研究还主要集中在Cas9蛋白的改进上。例如，有些研究表明可以通过提高Cas9的特异性和活性来降低脱靶率；还有些报道称可用Cas9的突变体Cas9 nickase来代替Cas9。因Cas9 nickase在靶位点进行切割时只使其中一条链断裂，同时将Cas9nickase与一对sgRNAs共表达，作用于靶位点的左右两侧，可以增强CRISPR/Cas系统发挥作用的特异性，脱靶率也大大降低。另外，Cas9与sgRNA的表达量以及两者的比例大小同样也影响着脱靶率的高低。并且，现在已经有以网页为基础的软件工具—CRISPR design tool 。它不仅可以指导靶位点的特异性选择，还可以进行脱靶分析。[28]虽然已经有科研工作者开始关注CRISPR/Cas系统的脱靶问题，也为该方面的研究提供了不少思路。但是随着基因时代飞速发展，急需对CRISPR/Cas系统的脱靶问题进行系统的研究。 5.结语和展望

基因编辑工具在植物生物学基础性和应用性研究中都具有十分重要的影响。它为植物功能基因的研究以及转基因功能作物的繁殖提供了有力的工具。随着三大人工核酸内切酶(ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9)的出现，基因编辑进入了新的时代。CRISPR/Cas9系统作为新型的基因编辑工具，受到越来越多的关注。该系统设计简单，成本低廉，特异性高，并且可以同时靶向多个基因，应用前景十分广阔。除了基因编辑这一主要应用，CRSPR/Cas系统还可以用于表观遗传学修饰，用于基因沉默，用于抑制或者激活基因的表达等等多种功能。但是仍有许多未解决的问题。例如，CRSPR/Cas系统作用的精确分子机制还不清楚；sgRNA的最佳长度是多少，才能有最高的效率；如何解决脱靶的问题等等。并且已报道的研究大多是细胞水平，如果该基因组定点修饰技术能够在农作物中得以应用，将为提高产量、改善营养价值等方面提供一条新的途径，具有潜在的应用前景。总之，CRSPR/Cas系统研究时间虽短，但是发展迅速，相信在不久的将来，这项技术的成熟发展将会加速许多基础以及应用性的研究进展。

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Fig.1 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑。绿色部分代表sgRNA,黑色部分代表靶序列，红色箭头的位置代表Cas9作用位点。

Fig.2 细菌的CRISPR/Cas系统作为获得性免疫系统，抵御外源病原体入侵的过程。