一、何为过继性免疫治疗？何为CIK细胞？
过继性免疫治疗是指通过回输体外培养扩增的免疫效应细胞，以提高机体抗肿瘤免疫功能的肿瘤治疗方法，是生物免疫治疗中最为成熟和有效的方法。目前用于回输的免疫效应细胞主要有淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK）和CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（CD3AK）等。
CIK是英文cytokine -induced killer 的缩写，中文译为细胞因子诱导的杀伤细胞。它是将人外周血单个核细胞（PBMC）在体外用多种细胞因子（抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其中CD3+CD56+细胞是CIK细胞群体中主要的效应细胞，被称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC（主要组织相容性复合体）限制性杀瘤优点。
二、CIK细胞如何发挥抗肿瘤作用？
1、CIK细胞可以直接杀伤肿瘤细胞：CIK细胞可以通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞的裂解。
2、CIK细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤作用：体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。
3、CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡：CIK细胞在培养过程中表达FasL（Ⅱ型跨膜糖蛋白）通过与肿瘤细胞膜表达的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡。
三、CIK细胞抗肿瘤作用有何特色？
1、增殖活性高：在培养的第15天数量就可以达到70多倍，其效应细胞CD3+CD56+的比例和数量更是明显增加,可以达到1000多倍；
2、杀瘤活性高，而且杀瘤活性的维持不需要外源大量的IL-2的输入来维持； 3、杀瘤谱广：CIK对肾癌、恶性黑色素瘤、白血病、乳腺癌、直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌、宫颈癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤（非T细胞淋巴瘤）等恶性肿瘤细胞都有显著的杀伤活性；
4、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感；
5、杀瘤活性不受CsA（环孢霉素A）和FK506（普乐可复）等免疫抑制剂的影响； 6、对正常骨髓造血前体细胞毒性很小：约为25%；
7、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡：CIK细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如Bcl-2等和survivin的转录水平上调。
四、CIK细胞疗法可用于哪些肿瘤的治疗？对哪几种肿瘤最有效？可用于肿瘤的哪一阶段（期）的治疗？
由于CIK细胞溶瘤作用是非MHC限制性的，即不受肿瘤组织类型的限制，因此对任何一种肿瘤均有杀灭作用。
CIK细胞对高抗原表达的肿瘤最为有效，比如恶性黑色素瘤、髓系白血病、肾癌、转移性肾癌、非何杰金氏淋巴瘤等。
CIK细胞可用于任何一期肿瘤的治疗。
五、CIK细胞疗法临床应用的适应症和禁忌症？
适应症：①手术后患者，可防止肿瘤转移复发；②无法进行手术、放疗、化疗的中晚期患者；③放疗、化疗失败的患者；④放疗或化疗后患者的综合治疗；⑤骨髓移植后或化疗缓解后的白血病患者；⑥癌性胸、腹腔积液患者。
禁忌症：①孕妇或者正在哺乳的妇女；② T细胞淋巴瘤患者；③不可控制的严重感染患者；④对IL-2等生物制品过敏的患者；⑤艾滋病患者；⑥正在进行全身放疗、化疗的患者；⑦晚期肿瘤造成的恶病质、外周血象过低患者。
六、CIK细胞疗法的良好临床疗效表现在哪些方面？
1、解决CT，MRI等影像学手段显示不到、直径0.5厘米以下、在血液中与淋巴系统里的活动着的癌细胞、微小病灶，预防肿瘤复发转移；
2、与放、化疗联合使用能降低放、化疗的毒副作用和感染率，提高放、化疗的疗效；与分子靶向治疗联合应用，可以提高其疗效；
3、对于没有机会手术和复发转移的晚期肿瘤病人，通过大量的CIK重复回输，不但能迅速缓解晚期肿瘤患者的症状，提高生存质量（增加食欲、改善睡眠、增强体质等），延长生存期；而且还出现瘤体缩小甚至消失或长期带瘤生存的机会。
七、肿瘤患者采用CIK细胞疗法为什么会有效？
通常情况下，肿瘤与机体防御处于动态平衡状态，而在肿瘤患者体内，其免疫功能特别是细胞免疫功能低下，导致平衡失调，因此肿瘤细胞迅速增殖、播散，疾病呈进行性发展，预后很差。体外扩增的大量活化CIK细胞输入患者体内后，一方面能够迅速执行杀伤肿瘤细胞的功能，其抗瘤作用可持续2周到1个月；另一方面通过整个免疫网络的激活，调整宿主的防御机制，达到控制肿瘤生长乃至使其消退的目的；最后，一部分记忆细胞在体外也得到了扩增，一旦遇到新的肿瘤细胞出现，能够迅速在体内活化，杀伤靶细胞。
八、CIK细胞疗法治疗肿瘤的临床疗效如何？
天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科从2000年开始CIK细胞的研究，并于2006年4月获得国家食品药品监督管理局批准进入临床试验。截至目前，共274例患者接受了CIK细胞治疗(男性198例，女性76例，平均年龄56.34岁)，其中消化道(包括食管、胃、肠及胰腺)肿瘤81例，肺癌54例，肝癌36例，肾癌29例，乳腺癌20例，淋巴瘤13例，其他41例。Ⅰ~Ⅱ期患者占17.1%，Ⅲ～Ⅳ期占82.9%。接受3个周期以上和2个周期治疗者分别为85例和48例，最多治疗34次。总有效率达35%。除一过性发热、寒战外未发现其他副作用。 青岛生物治疗中心共治疗无法手术的晚期肿瘤病人67例，病人的肿瘤类型：肺癌22例，卵巢癌9例，胃癌8例，结肠癌和食道癌各5例，恶性黑色素瘤3例，淋巴瘤3例，乳腺癌、肾癌、胆管癌各2例，喉癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、膀胱癌各1例。肿瘤分期：I～IIIA期0例，IIIB期5例，IV期62例。肿瘤分化程度：高分化6例，中分化18例，低分化和未分化43例。经CT、其他影像学检查和肿瘤标志物检测，67例病人中完全缓解者（CR）7例，部分缓解（PR）10例，轻微缓解（MR）16例，稳定（SD）17例，进展（PD）17例。总有
效率（CR+PR+MR）为49%，进展的病例仅占总数的26%。治疗后56例病人有体力改善、食欲增加、身体不适或放化疗的副作用明显减轻等表现，占总数84%；其中9例病人帕金森氏病和关节炎明显缓解。67例病人中1年前结束治疗的病人41例，存活超过1年的25例，1年存活率为61%。
九、CIK细胞是如何制备的？加入CIK细胞培养体系中各细胞因子的作用？
无菌采集患者外周抗凝血20~50ml→制备外周血单个核细胞（PBMC）→顺次加入IFN-γ、抗CD3McAb、IL-2、IL-1α细胞因子诱导产生CIK→CIK细胞体外大量扩增培养→收获CIK细胞。
IFN-γ作用是上调PBMC细胞膜表面IL-2受体表达；抗CD3McAb模拟生理配体体外激活静止T细胞，使之大量增殖，表达IL-2受体，产生内源性IL-2；IL-2俗称淋巴细胞生长因子，能够促进CIK细胞大量增殖；IL-1α能增强CIK细胞的抗肿瘤毒性。
十、CIK细胞如何回输病人体内？以及回输后的处理？
通过输血器将CIK细胞悬液静脉滴注输给患者，输CIK当天起每日给予IL-2 50-100万IU，连续2～5天。
十一、CIK疗法的不良反应及处理？
CIK细胞是诱导、激活的自体细胞，这种治疗相当安全，一般没有严重的不良反应。CIK 细胞治疗中可能出现的主要副作用是寒战、发热、乏力。发热常常出现在治疗后4～8 h，体温一般38℃左右，发热在2～4 h 内常可缓解，不需特殊处理。对体温超过39℃ 的患者可用退热药解除症状。极少数患者可能出现恶心等消化道症状，个别患者可见皮疹等过敏反应，给予对症处理可缓解症状。
十二、患者进行CIK细胞治疗的治疗方案？需治疗几个疗程才有效？何时需要重复加强？
CIK生物治疗的疗程及疗程间隔取决于以下几个方面：
1、免疫情况（年龄、体质、精神压力、营养、其他疾病等）； 2、临床分期与病灶情况（肿瘤大小、转移情况等）；
3、个体化生活习惯差异（饮食、睡眠、工作、运动等）；
4、已接受或计划接受的癌症治疗方法（手术、放、化疗等）； 5、阶段性疗效评估 (血象与影像学报告等)； 6、经济能力；
7、患者与家属对治疗目标疗效的期望与共识。
临床应用参照表
0期 -Ⅰ期 病灶小于2cm
单疗程次数 疗程间隔
4-8次 3-9月
Ⅱ期 病灶大于2cm
肿瘤临床分期
Ⅲ期
复发、远处转移、不能手术
Ⅳ期
多处转移、带瘤存活
8-12次 3-6月
12-16次 1-3个月
16次以上 1-3个月
患者平均每周采血1次，每次20～30ml。从采血开始分离培养时间计，第8～12天开始输注CIK细胞，每周2～3次。每次输注的细胞数在1×109以上，整个疗程不少于1×1010个细胞。
或者采血50ml，从采血当天计，第14天给予一次性回输CIK细胞不少于1×1010个，进行强化治疗。
十三、如何使CIK细胞疗法发挥更大疗效？
在CIK 细胞治疗过程中，输入细胞的疗程采用“细水长流”式长期治疗或“重点投入”式治疗需要因人和病情不同而异，需要严格评价和分析患者的身体状况和肿瘤的发展势头，特
别是CIK 治疗与其他治疗方法的联合。
十四、异体+自体CIK细胞治疗的适应症？操作流程？不良反应？
对于免疫功能极其低下的中晚期患者，由于其体内CIK前体细胞数量少，导致体外扩增难度大，获得的细胞数量少，活性低，难达到治疗效果，所以建议先进行异体CIK细胞治疗，待患者体质恢复一定程度后，再行自体CIK细胞治疗。具体操作为先动员患者的直系亲属进行乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒病原学检测，合格后捐献20～30ml抗凝血，我们在体外扩增培养，然后回输患者体内。可能会出现极为罕见的移植物抗宿主反应，其它不良反应见自体CIK细胞治疗。
十五、CIK细胞疗法收费标准？
CIK细胞疗法的收费是根据广东省物价局、广东省卫生厅2006年6月颁布的《中央、军队、武警、省属驻穗非营利性医疗机构服务价格》中规定而定的，3000元/2次。每回输10亿细胞计为1次。（编号：310800024）
十六、目前国内开展CIK细胞疗法的医疗机构有哪些？
目前国内多个医疗单位相继开展了CIK细胞的临床应用，包括北京大学第一人民医院、天津医科大学肿瘤医院、解放军301医院、北京道培医院、解放军302医院、青岛市中心医院、北京协和医院、陕西省肿瘤生物治疗中心、南方医院、中山大学肿瘤医院等。
十七、CIK细胞应用前景展望？
早在2000年美国“国际肿瘤生物/免疫治疗及基因治疗”年会总结报告中就指出：“生物治疗是目前知道的唯一一种有望完全消灭癌细胞的治疗手段，21世纪是肿瘤生物治疗的时代”。CIK细胞疗法更是具有广泛的发展前景，可以与DC或者NK细胞联合应用，增加靶向性及杀瘤活性；可以通过基因修饰的方法，将IL-2、G-gp等基因转染至CIK细胞内，增加其活性；可以通过不断优化CIK体外扩增体系，增加CIK细胞的数量及活力。
过继性免疫细胞治疗之CIK细胞疗法
作者：龚守军 文章来源：济南中山肝病医院 点击数：
518 更新时间：2010-1-16
一、何为过继性免疫细胞治疗？何为CIK细胞？
过继性免疫细胞治疗是指通过回输体外培养扩增的免疫效应细胞，达到放大机体抗肿瘤免疫目的的肿瘤治疗方法，是生物免疫治疗中最为成熟和有效的方法。目前用于回输的免疫效应细胞主要有淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK），肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），树突状细胞（DC），自然杀伤细胞（NK），CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（CD3AK）等。
CIK是英文cytokine -induced killer 的缩写，中文译为细胞因子诱导的杀伤细胞。它是将人外周血单个核细胞（PBMC）在体外用多种细胞因子（抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其中CD3+CD56+细胞是CIK细胞群体中主要的效应细胞，被称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC（主要组织相容性复合体）限制性杀瘤优点。
二、CIK细胞抗肿瘤的作用机制？
1、CIK细胞可以直接杀伤肿瘤细胞：CIK细胞可以通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，这些颗粒直接穿透封闭的肿瘤细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解。
2、CIK细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤作用：体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。
3、CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡：CIK细胞在培养过程中表达FasL（Ⅱ型跨膜糖蛋白）通过与肿瘤细胞膜表达的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡。
三、与其它过继性免疫治疗相比，CIK细胞的优势？
1、增殖活性高：在培养的第15天数量就可以达到70多倍，第22天左右达到增殖曲线顶峰，大约为100多倍，其效应细胞CD3+CD56+的比例和数量更是明显增加；
2、杀瘤活性高，而且杀瘤活性的维持不需要外源大量的IL-2的输入来维持；
3、杀瘤谱广：CIK对肾癌、恶性黑色素瘤、白血病、乳腺癌、直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌、宫颈癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤（非T细胞淋巴瘤）等恶性肿瘤细胞都有显著的杀伤活性；
4、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感；
5、杀瘤活性不受CsA（环孢霉素A）和FK506（普乐可复）等免疫抑制剂的影响；
6、对正常骨髓造血前体细胞毒性很小：约为25%；
7、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡：CIK细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如Bcl-2等和survivin的转录水平上调。
四、CIK细胞疗法可用于哪些肿瘤的治疗？对哪几种肿瘤最有效？可用于肿瘤的哪一阶段（期）的治疗？
由于CIK细胞溶瘤作用是非MHC限制性的，即不受肿瘤组织类型的限制，因此对任何一种肿瘤均有杀灭作用。 CIK细胞对高抗原表达的肿瘤最为有效，比如恶性黑色素瘤、髓系白血病、肾癌、转移性肾癌、非何杰金氏淋巴瘤等。 CIK细胞可用于任何一期肿瘤的治疗。
五、CIK细胞疗法临床应用的适应症和禁忌症？
适应症：①手术后患者，可防止肿瘤转移复发；②无法进行手术、放疗、化疗的中晚期患者；③放疗、化疗失败的患者；④放疗或化疗后患者的综合治疗；⑤骨髓移植后或化疗缓解后的白血病患者；⑥癌性胸、腹腔积液患者。
禁忌症：①孕妇或者正在哺乳的妇女；② T细胞淋巴瘤患者；③不可控制的严重感染患者；④对IL-2等生物制品过敏的患者；⑤艾滋病患者；⑥正在进行全身放疗、化疗的患者；⑦晚期肿瘤造成的恶病质、外周血象过低患者。
六、CIK细胞疗法的良好临床疗效表现在哪些方面？
1、解决CT，MRI等影像学手段显示不到、直径0.5厘米以下、在血液中与淋巴系统里的活动着的癌细胞、微小病灶，预防肿瘤复发转移；
2、与放、化疗联合使用能降低放、化疗的毒副作用和感染率，提高放、化疗的疗效；与分子靶向治疗联合应用，可以提高其疗效；
3、对于没有机会手术和复发转移的晚期肿瘤病人，通过大量的CIK重复回输，不但能迅速缓解晚期肿瘤患者的症状，提高生存质量（增加食欲、改善睡眠、增强体质等），延长生存期；而且还出现瘤体缩小甚至消失或长期带瘤生存的大量病例。
七、肿瘤患者采用CIK细胞疗法为什么会有效？
通常情况下，肿瘤与机体防御处于动态平衡状态，而在肿瘤患者体内，其免疫功能特别是细胞免疫功能低下，导致平衡失调，因此肿瘤细胞迅速增殖、播散，疾病呈进行性发展，预后很差。体外扩增的大量活化CIK细胞输入患者体内后，一方面能够迅速执行杀伤肿瘤细胞的功能，其半衰期可持续2周到1个月；另一方面通过整个免疫网络的激活，调整宿主的防御机制，达到控制肿瘤生长乃至使其消退的目的；最后，一部分记忆细胞在体外也得到了扩增，一旦遇到新的肿瘤细胞出现，能够迅速在体内活化，杀伤靶细胞。
八、CIK细胞是如何制备的？加入CIK细胞培养体系中各细胞因子的作用？
无菌采集外周抗凝血20～50ml→制备外周血单个核细胞（PBMC）→顺次加入IFN-γ、抗CD3McAb、IL-2、IL-1α细胞因子诱导产生CIK→CIK细胞体外大量扩增培养→收获CIK细胞。
IFN-γ作用是上调PBMC细胞膜表面IL-2受体表达；抗CD3McAb模拟生理配体体外激活静止T细胞，使之大量增殖，表达IL-2受体，产生内源性 IL-2；IL-2俗称淋巴细胞生长因子，能够促进CIK细胞大量增殖；IL-1α能增强CIK细胞的毒性。
九、CIK细胞如何回输病人体内？以及回输后的处理？
通过输血器静脉将CIK细胞悬液输给患者，输注时间>30min，输CIK当天起每日给予IL-2 50-100万IU，连续2-5天。
十、CIK疗法的不良反应及处理？
对于自体CIK细胞治疗，CIK细胞是诱导、激活的自体细胞，这种治疗相当安全，一般没有严重的不良反应。CIK 细胞治疗中可能出现的主要毒副作用是寒战、发热、乏力。发热常常出现在治疗后4～8 h，体温一般38℃左右，发热在2～4 h 内常可缓解，不需特殊处理。对体温超过39℃ 的患者可用退热药解除症状。极少数患者可能出现恶心等消化道症状，个别患者可见皮疹等过敏反应，给予对症处理可缓解症状。对于异体CIK细胞治疗，可能会发生极为罕见的移植物抗宿主反应。
十一、患者进行CIK细胞治疗的治疗方案？需治疗几个疗程才有效？何时需要重复加强？
CIK生物治疗的疗程及疗程间隔取决于以下几个方面：
1、免疫情况（年龄、体质、精神压力、营养、其他疾病等）；
2、临床分期与病灶情况（肿瘤大小、转移情况等）；
3、个体化生活习惯差异（饮食、睡眠、工作、运动等）；
4、已接受或计划接受的癌症治疗方法（手术、放、化疗等）；
5、阶段性疗效评估 (血象与影像学报告等)；
6、经济能力；
7、患者与家属对治疗目标疗效的期望与共识。
临床应用参照表
对于普通型CIK细胞治疗，患者平均每周采血1次，每次20～30ml。从采血开始分离培养时间计，第8～12天开始输注CIK 细胞，每周2～3 次。每次输注的细胞数不 < 1×109，整个疗程不<1×1010个细胞。
对于增强型CIK细胞治疗，患者每两周采血1次，每次50ml，从采血开始分离培养时间计，第14天给予输注CIK细胞，每次数量不<1×1010个细胞。
十二、如何使CIK细胞疗法发挥更大疗效？
在CIK 细胞治疗过程中，输入细胞的疗程采用“细水长流”式长期治疗，即普通型或“重点投入”式治疗，即增强型，需要因人和病情不同而异，需要严格评价和分析患者的身体状况和肿瘤的发展势头，特别是CIK 治疗与其他治疗方法的联合。
十三、异体+自体CIK细胞治疗的适应症？操作流程？不良反应？
对于免疫功能极其低下的中晚期患者，由于其体内CIK前体细胞数量少，导致体外扩增难度大，获得的细胞数量少，活性低，难达到治疗效果，所以建议先进行异体CIK细胞治疗，待患者体质恢复一定程度后，再行自体CIK细胞治疗。具体操作为先动员患者的直系亲属进行乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒病原学检测，合格后捐献20～30ml抗凝血，我们在体外扩增培养，然后回输患者体内。可能会出现极为罕见的移植物抗宿主反应，其它不良反应见自体CIK细胞治疗。
十四、CIK细胞疗法收费标准？
CIK细胞疗法的收费是根据广东省物价局、广东省卫生厅2006年6月颁布的《中央、军队、武警、省属驻穗非营利性医疗机构服务价格》中规定而定的，3000元/2次（普通型）（编号：310800024）。增强型的收费为12000元/次。 十五、CIK细胞应用前景展望？
早在2000年美国“国际肿瘤生物/免疫治疗及基因治疗”年会总结报告中就指出：“生物治疗是目前知道的唯一一种有望完全消灭癌细胞的治疗手段，21世纪是肿瘤生物治疗的时代”。CIK细胞疗法更是具有广泛的发展前景，可以与DC或者NK细胞联合应用，增加靶向性及杀瘤活性；可以通过基因修饰的方法，将IL-2、G-gp等基因转染至CIK细胞内，增加其活性；可以通过不断优化CIK体外扩增体系，增加CIK细胞的数量及活力。
临床级树突状细胞的分离和培养(一)
作者：王坤 吴一龙 转自：第三届中国肿瘤学术大会 发布时间：2006年8月3日 11时22分
Abstract: Objective To study the method for generation large-scale mature dendritic cells from nonproliferation progenitors in patient’s blood. Methods The procedure uses 5% AB human plasma in the place of 10% fetal calf serum and involves two steps. The first step is to work on a 5-7 day culture of plastic-adherent blood monocyte cells in medium supplemented rhGM-CSF and rhIL-4. The second step is to expose to monocyte conditioned medium mimic or TNF-α. Results There was no significant difference observed in dendritic cells yield and purity when 5% AB human plasma replace 10% fetal calf serum. Dendritic cells exposed to monocyte conditioned medium mimic express a higher percentage of restricted mature marker CD83+ and stronger T cell stimulatory function comparing to expose to TNF-α.Conclusion We suggest that these mature dendritic cells will be effective in vivo as adjuvant for active immunotherapy. Key words: Dendritic Cell; Monocyte Conditioned Medium Mimic；Mature Regulation; Immunotherapy
摘要：目的 探讨从患者外周血树突状细胞前体培养足够数量的树突状细胞及调控其成熟的方法。方法 完全培养基用5％人AB型血浆代替10％胎牛血清，培养过程分两阶段，第一阶段：从患者外周血分离出能粘附塑料的单核细胞,在GM-CSF+IL-4存在条件下培养5～7d;第二阶段,加入模拟单核细胞条件性培养液或TNF-α促进树突状细胞分化成熟。 结果 5％人AB型血浆代替10％胎牛血清后，在树突状细胞的得率和纯度方面无统计学差异，模拟单核细胞条件性培养液使树突状细胞表达更高比例的成熟标志CD83＋，具有更强的刺激T细胞的能力。结论 通过以上方法培养的成熟树突状细胞将能有效地应用于临床免疫治疗。
关键词：树突状细胞；模拟单核细胞条件培养液；成熟调控；免疫治疗 中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-8578（2004）
0 引言
树突状细胞( Dendritic cell, DC)是人体内功能最强也是体内唯一能活化静息T细胞的抗原递呈细胞。近年来国内外研究表明，DC在体外和体内都能诱导细胞毒性T淋巴细胞发挥特异性肿瘤杀伤作用，成熟的DC是激发免疫反应的关键。但由于体内DC含量少，难以满足临床应用的需要，因此获得大量成熟的DC是临床应用的基础。本实验研究了从患者外周血树突状细胞前体培养足够数量的DC及调控其成熟的方法。
1 材料与方法
1.1 试剂 培养基RPMI-1640购自Gibco公司；细胞因子人重组IL-4、GM-CSF、IL-2、IL-1β、PGE2、IL-6及TNF-α购自PeproTech EC公司。荧光抗体：PE标记的鼠抗人CD14单抗、CD83单抗、HLA-DR单抗、FITC标记的鼠抗人CD86单抗、CD40单抗、HLA-A、B、C单抗及羊抗鼠二抗购自Pharmingen公司；MTT和DMSO为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，胎牛血清购自杭州四季青公司，正常人AB型血浆由广州市中心血站提供。完全培养基两种：一种为RPMI-1640＋10％胎牛血清，另一种为RPMI-1640＋5％AB型血浆。
1.2 病例选择 15例经病理证实为肺癌患者，年龄29～78岁，平均年龄58.6岁，男11例，女4例，鳞癌2例，腺癌13例。
1.3 DC的体外培养及成熟 采集肿瘤患者外周血20ml，肝素抗凝（20U肝素/1ml全血）。将全血用RPMI-1640对倍稀释，充分混匀。取50ml离心管，加入10ml Ficoll－Paque Plus（淋巴细胞分离液），在其上缓慢加入20ml血液，2000rpm离心20min，小心吸取富含单个核细胞的细胞层（PBMC），用5倍体积的PBS洗涤2次：1500rpm离心10min。用RPMI-1640洗涤1次，1500rpm离心5min，用0.2%胎盘蓝进行活细胞计数。10例患者随机使用一种完全培养液重悬细胞，调整细胞密度为2×106/ml, 加入12孔板，每孔2×106，37℃ 5％CO2培养箱孵育2小时。轻摇培养板，用吸管取出上清及非贴壁细胞留作后用，剩余的贴壁细胞用温RPMI-1640洗涤2次，加入RPMI-1640，24h后小心取出上清，再加入完全培养基内含rhGM-CSF 1000U/ml， rhIL-4 1000U/ml, 37℃ 5％CO2培养箱孵育5～7天收获未成熟DC。含人AB型血浆的完全培养基培养的DC自第6天始随机加入TNF-α
10ng/ml或模拟单核细胞条件培养液（monocyte conditioned medium mimic , MCM mimic ; IL-1β10ng/ml、PGE2 1ug/ml、IL-6 1000u/ml及TNF-α10ng/ml）第9～10d天收获成熟DC。
1.4 DC的得率与纯度 用倒置显微镜下观察第1、3、5、7和9天的DC生长及形态学变化情况，进行DC的得率与纯度的计算。
DC得率=
第9天收获的DC细胞数 ×100％ 第1天孵育的单个核细胞总数
DC纯度=
第9天收获的DC细胞数 ×100％ 第9天收获的DC细胞数+单个核细胞数
1.5 流式细胞仪细胞表型检测 用流式细胞标记液PBA(0.01M PBS＋2%BSA＋0.01%NaN3)悬浮细胞5～10×105/ml, 加入离心管（100ul/管），再加入荧光标记的一抗100ul, 单抗浓度为5ug/ml, 4℃，30min ，PBS洗细胞2次，加入羊抗鼠IgG荧光二抗200ul/管，悬浮细胞，二抗浓度为2ug/ml, 4℃暗处标记30min，PBS洗2次，细胞悬于含有1％多聚甲醛的PBS荧光染色细胞保存液中。流式细胞仪(美国Bio－RAD公司)表型分析。
1.6 混合淋巴细胞培养（MLR） 刺激细胞：收集第9～10d DC组，调整细胞密度为1×106/ml，加入丝裂霉素25ug/ml, 37℃，30min处理并充分洗涤，再调整细胞密度为10×104/ml、2×104/ml、1×104/ml。效应细胞：按上述方法分离同种异体来源的PBMC, 调整细胞密度为1×106/ml。U形底96孔板，每孔加刺激细胞和效应细胞各100ul，每个样品设3个复孔，并设空白对照。37℃，5％CO2培养5d。加入MTT20ul, 37℃ 5％CO2孵箱培养4h，离心，小心吸去180ul培养液，加入DMSO100ul， 在微量振荡器上振荡15min。酶标仪570nm处测OD值，计算刺激指数，SI=试验组OD值/对照组OD值。
1.7 统计学处理 使用SPSS 10.0软件进行数据的多变量方差分析，P<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 DC体外培养形态
患者外周血单个核细胞（PBMC）, 贴壁培养2h, 获得贴壁细胞。第1天，细胞贴壁，体积小，多为圆形，有少量半悬浮细胞；第3天，半悬浮细胞逐渐增加，细胞呈聚集现象，体积略增大，有大突起；第5天，大部分细胞脱壁悬浮，体积增大，形状不规则；第7天，细胞体积大，脱壁悬浮，有毛刺状突起；第9天，细胞突起变细，变多，为典型的DC形状（图1）。 2.2 DC获得率、纯度和成熟时间
完全培养基中用人AB型血浆取代胎牛血清，发现在DC获得率、纯度和成熟所需时间上两者无统计学显著性差异(F=1.165,P>0.05)。
目的:树突状细胞是初始免疫反应中最重要的抗原提呈细胞.本研究目的是分析脐带血的细胞组成,研究加入细胞因子培养前后脐血树突状细胞的变化,以脐血为来源探索体外诱导、扩增树突状细胞的方法并进行表型鉴定.方法:脐血12例,分离单个核细胞.在脐血单个核细胞中加入细胞因子粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)、造血干细胞生长因子(SCF)和促红细胞生成素(EPO),培养4周.应用流式细胞仪,使用CD4、CD8、CD19、CD34、CD38、CD1a、CD11c和CDw123单克隆抗体,测定培养前及培养后1、2、3、4周脐血细胞的细胞表面抗原变化及树突状细胞情况.结果:新鲜脐血单个核细胞中CD34+造血干细胞0.22×108/L、CD1a+细胞0.27×108/L、CD11c+细胞5.87×108/L、CD83+细胞1.94×108/L、CDw123+细胞2.73×108/L.加入细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF、EPO后培养1～4周的脐血单个核细胞分化为CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+树突状细胞,在培养的2～4周,脐血树突状细胞数量明显增多,此后逐渐减少.通过培养,树突状细胞数量增加达CD1a+细胞11.02×108/L、CD11c+细胞28.24 × 108/L、CD83+细胞10.57×108/L、CDw123+细胞18.7×108/L.结论:在培养液中加入细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF和EPO后培养2～4周,脐血单个核细胞可分化为CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+树突状细胞.这些树突状细胞作为抗原提呈细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用.
CIK
CIK（cytokine-induced killer）是细胞因子诱导的杀伤细胞的简称。
CIK细胞最早是1991年由美国斯坦福大学生物学专家首次报道。他们发现在多种细胞因子(γ干扰素、CD3单抗、白介素-1和白介素-2)作用下，外周血淋巴细胞可以被定向诱导并大量增殖成为肿瘤杀伤细胞。 CIK细胞（cytokine-induced killer）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等共同培养一段时间后获得的一群异质性细胞。CIK细胞兼具有T淋巴细胞的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的优选细胞。
同时CIK细胞是一种新型免疫活性细胞，它是自体外周血单个核细胞，经多种细胞因子共同诱导培养产生的一类CD3+和CD56+共同表达的高细胞毒细胞（杀伤细胞）。它是由美国斯坦福（Stanford）大学最先研制的，兼有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞（NK）的非主要组织相关性复合物（MHC）限制性杀瘤的特点，杀伤活性可达84.7%。
CIK细胞制备流程
CIK细胞具有增殖快、杀瘤活性强、杀瘤谱广的优点，尤其是对化疗耐药的肿瘤细胞株亦有杀伤作用，而对正常造血集落的生长没有影响。通过取病人少量单个核细胞，在体外特定条件下制备出大量CIK细胞，回输体内后直接发挥有效清除肿瘤作用。
树突状细胞（Dendritic Cells,DC）
树突状细胞（Dendritic Cells,DC）是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞（Antigen presenting
DC作用机制
Cells,APC），能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。DC于1973年首次由Steinman和Cohn发现。其后的好长时间里，由于受当时生物学技术的限制，人们没办法在体外培育更多的树突状细胞，且价格昂贵，结果造成对它研究没能进一步深入下去。进入九十年代，人类在生物学技术方面取了长足进步，能够在体外培养树突状细胞了，对DC的研究也就有了突破性的进展。二十世纪末美国率先
开始在人体上进行树突状细胞免疫治疗肿瘤的试验。其结果令人倍受鼓舞。接着而来的是：树突状细胞成了肿瘤生物治疗的明星，也成了全世界与癌症奋斗的科学家们研究的热点。
树突状细胞就是人体免疫系统的哨兵，它能敏锐的捕捉肿瘤细胞与正常细胞那微小的差异，并把这种差异伟递给人体免疫系统中的武警——T淋巴细胞，让T淋巴细胞接受到识别叛乱分子的办法和作战命令，迅速由静息状态转化为战斗状态，将人体内残存的、转移的癌细胞全部、知彻底的消灭干净。并且T细胞免疫还有记忆能力，也就是说人的一生中再有同样的癌细胞产生，人体的免疫系统就会马上把癌细胞给干掉。所以树突状细胞免疫治疗又被称为治疗性疫苗（和我们日常用的预防性疫苗相对而言）。
NK 百科名片
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。 目录[隐藏]
一、NK细胞的来源 二、NK细胞的表型 三、NK细胞的活化 四、 NK细胞的功能 一、NK细胞的来源 二、NK细胞的表型 三、NK细胞的活化 四、 NK细胞的功能
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一、NK细胞的来源
NK细胞确切的来源还不十分清楚，一般认为直接从骨髓中衍生，其发育成熟依赖于骨髓的微环境。小鼠和人的体外实验表明，胸腺细胞在体外IL-2等细胞因子存在条件下培养也可诱导出NK细胞。小鼠脾脏在体内IL-3诱导下可促进NK细胞的分化。NK细胞主要分布于外周血中，占PBMC 5～10％，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。
由于NK细胞具有部分T细胞分化抗原，如80～90％NK细胞CD2+，20～30％NK细胞CD3+(表达CD3δ链)，30％NK细胞CD8+(α/α)和75～90％NK细胞CD38+,而且NK细胞具有IL-2中亲和性受体，在IL-2刺激下可发生增殖反应,活化NK细胞可产生IFN-γ，因此一般认为NK细胞与T细胞在发育上关系更为密切。 [编辑本段]
二、NK细胞的表型
与T细胞、B细胞相比，NK细胞表面标志的特异性是相对的。人NK细胞mIg-,部分NK细胞CD2、CD3和CD8阳性，表达IL-2受体β链 (P75,CD122)，CD11b/CD18阳性。目前常用检测NK细胞的标记有CD16、CD56、CD57、CD59、CD11b、CD94和LAK-1(见表7-10)。
最近发现的一种稳定表达在NK和LAK细胞表面的LAK-1分子，120kDa，NK细胞在IL-2条件下培养20天LAK-1仍为阳性，而HNK-1(CD57)和CD16部分消失。LAK的杀伤活性可被抗LAK-1 McAb所抑制。 表7-10 检测人NK细胞常用的标志
表7-11 NK细胞和其它细胞毒效应细胞的表面标志(％) [编辑本段]
三、NK细胞的活化
NK细胞可通过多种途径被活化，包括膜表面的CD2、CD3分子和多种细胞因子。
1. 通过CD3分子的δ链 NK细胞不表达TCR/CD3复合物，但部分NK细胞表达CD3δ链，当用CD16抗体刺激NK细胞活化时，δ链发生酪氨酸磷酸化，引起胞浆内
２＋
浓度升高，IP3水平增加，促进细胞因子合成和ADCC作用。
2. 通过CD2分子 CD2与CD58相互作用或用CD2 McAb刺激可活化NK细胞，CD3 δ链发生酪氨酸磷酸化。
3. 自然杀伤细胞刺激因子 自然杀伤细胞刺激因子(natural killer cell stimulatory factor, NKSF) 对NK细胞有刺激作用。
IL-2、IL-12、IFN-α、TNF-α以及白细胞调节素(leukoregulin, LR) 对NK细胞的活化和分化有正调节作用， 体外培养时加入上述细胞因子可明显提高NK的杀伤活性。 前列腺素 (PG)E1、E2、D2和肾上腺皮质激素等对NK细胞的活性有抑制作用。
NK细胞表面具有IL-2中亲和性受体，IL-2诱导NK的杀伤活性约需18～24小时。此外，IL-2还可诱导NK细胞的增殖，一般在刺激后3～4天开始发生增殖，其机理为IL-2可诱导NK细胞表达IL-2Rα链，新表达的α链与原先细胞表面的β链和γ链结合形成高亲和性受体,在IL-2存在下刺激NK细胞发生增殖。IL-2诱导NK细胞的活性机理尚不清楚，可能与增加细胞粘附分子的表达，提高对NK抵抗靶细胞的杀伤活性有关，还可能增加NK细胞胞浆中的颗粒以及丝氨酸酯酶mRNA的表达，活化和促进杀伤介质的杀伤作用。 [编辑本段]
四、 NK细胞的功能 (一)自然杀伤活性
由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。 NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。
1. 识别靶细胞 NK细胞识别靶细胞是非特异性的，这与CTL识别靶细胞机理不同，但确切的机理尚未明了。现已知淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1) 与靶细胞表面的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的作用参与NK细胞的识别过程，抗LFA-1或抗ICAM-1 McAb可抑制NK细胞的杀伤活性。此外CD2与LFA-3(CD58)结合以及CD56也可能介导NK细胞与靶细胞的结合。有关白细胞分化抗原和粘附分子分别参见第一章和第二章。
2. 杀伤介质 主要有穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等。
(1) 穿孔素: 穿孔素是一种由NK、CTL、LAK等杀伤细胞胞浆颗粒释放的杀伤靶细胞的介质，有关穿孔素的结构和功能参见本章第二节。从胞浆颗粒中纯化的穿孔素在体外能溶解多种肿瘤细胞，抗穿孔素抗体可抑制杀伤活性。IL-2可提高穿孔素基因的转录。IL-6可以促进IL-2对穿孔素基因转录的诱导作用。丝氨酸酯酶可能有活化穿孔素的作用。
(2) NK细胞毒因子: NK细胞可释放可溶性NK细胞毒因子(NK cytotoxic factor, NKCF),靶细胞表面有NKCF受体，NKCF与靶细胞结合后可选择性杀伤和裂解靶细胞。
(3) TNF: 活化的NK细胞可释放TNF-α和TNF-β(LT)，TNF通过①改变靶细胞溶酶体的稳定性，导致多种水解酶外漏；②影响细胞膜磷脂代谢；③改变靶细胞糖代谢使组织中pH降低；④以及活化靶细胞核酸内切酶，降解基因组DNA从而引起程序性细胞死亡等机理杀伤靶细胞。TNF引起细胞死亡过程要明显慢于穿孔素溶解细胞的作用过程。 表7-12 人和小鼠NK敏感和不敏感靶细胞 (二)ADCC
(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 表7-13 NK细胞产生的细胞因子
NK细胞表面具有FcγRⅢA,主要结合人IgG1和IgG3的Fc段(Cγ2、Cγ3功能区),在针对靶细胞特异性IgG抗体的介导下可杀伤相应靶细胞。 IL-2和IFN-γ明显增强NK细胞介导的ADCC作用。以前认为在淋巴细胞中由K细胞介导ADCC,但至今仍未发现K细胞特异的表面标记,也不能证实K细胞是否属于一个独立的细胞群， 很可能NK是介导ADCC的一个主要淋巴细胞群。具有ADCC功能的细胞群除NK外，还有单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。 (三)分泌细胞因子
活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。
此外，NK细胞可抑制PWM体外诱导B细胞的 分化及抗体应答， 其机理可能通过直接抑制B 细胞或抑制辅佐细胞的抗原提呈作用。 NK细胞通过自然杀伤和ADCC发挥的细胞毒作用，在机体抗病毒感染、免疫监视中起重要作用。(1) 抗病毒感染: NK可选择性地杀伤病 毒感染的靶细胞。由辅佐细胞或NK细胞所产生 的IFN可协同NK的抗病毒作用， 而对正常细胞 有保护作用。另一方面，病毒感染细胞表面的 病毒抗原和其它表面分子使得其对NK的杀伤细 胞作用变得更加敏感。在体外，NK可溶解疱疹 病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒和流感病毒感染的靶细胞。体内试验表明， NK低活性小鼠品系对某些病毒感染更加敏感；注射抑制NK细胞的抗Asialo GM1抗体可加重小鼠流感病毒性肺炎。此外，NK细胞在体外还可杀伤某些细菌、真菌、原虫等，可能与NK细胞释放某些杀伤介质有关。(2)NK细胞在免疫监视、杀伤突变的肿瘤细胞可能比T细胞具有更重要的作用。 某些疾病如Chediak-Higashi或X性联淋巴增殖综合征患者， 由于NK功能缺陷对恶性淋巴细胞增殖疾病特别易感。(3)参与骨髓移植后移植物抗白血病效应 (graft-versus-leukemia effect,GVL): 在体外NK细胞可杀伤某些淋巴样和髓样白血病细胞。骨髓移植后数周内，来自供体的NK细胞在PBL中占相当高的比例。 此外，在体内NK细胞还可杀伤某些不成熟细胞如骨髓干细胞、胸腺细胞亚群等。
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