第２３卷第１期 ２０１０年３月 聊城大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｍ￣ｏｆ Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．） Ｖ０１．２３ Ｎｏ．Ｉ Ｍ８ｒ．２Ｏｌ０ 不同铁盐对拟南芥下胚轴愈伤组织诱导的影响 孙 哲 陈 彦２ （１．聊城大学农学院，山东聊城２５２０５９；２．聊城大学生命科学学院，山东聊城２５２０５９） 摘要以拟南芥（Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓｔｈａｌｉａｎａ）下胚轴为外植体，将其分别接种于含有不同铁盐（Ｆｅ— ＥＤＴＡ，ＦｅＣ１：，ＦｅＣ１，，ＦｅＳＯ ，Ｆｅ：（ＳＯ ），，柠檬酸铁）的Ｂ５的培养基上，观察愈伤组织形成的情况． 结果表明，以柠檬酸铁取代Ｆｅ—ＥＤＴＡ的改良Ｂ 培养基是诱导拟南芥下胚轴产生愈伤组织的最 佳培养基． 关键词拟南芥，愈伤组织，铁盐 中图分类号ｓｌ１８ 文献标识码Ａ 文章编号１６７２－６６３４（２０１０）０１－００５２－０３ 无机物质是植物生长发育所需的化学元素，包括大量元素和微量元素．在微量元素中，铁是植物必需 也是需要量最大的元素…，在植物的生命活动如光合作用、呼吸作用、氮代谢中起着重要作用 Ｊ．早在十 九世纪，铁作用就与大量元素同时被确认 Ｊ．萨克斯 等人认为铁在愈伤组织的诱导中是必需的，因此基 本培养基中铁盐是不可缺的．早期培养基或培养液配方中最先采用Ｆｅ （ｓＯ ），，后又用ＦｅＣ１，代替之【４】，但 是实验证明二者都不是理想的铁供应源．为了保证铁素的稳定供应，目前多数培养基都是以Ｆｅ—ＥＤＴＡ为 铁源，因此人们研究了ＭＳ培养基中Ｆｅ—ＥＤＴＡ的浓度对愈伤组织诱导的影响．楼程富等 研究发现提高 ＭＳ培养基中的Ｆｅ—ＥＤＴＡ浓度有利于桑愈伤组织的形成．但是不同铁盐对下胚轴愈伤组织形成影响的研 究至今未见报道，为此，我们作了相关的工作。 拟南芥（Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓｔｈａｌｉａｎａ）是植物生物学研究的模式材料，因其生长周期短、个体性态小、种子多、 基因组简单、突变体众多、生长发育指标资料全面等特点而被广泛使用． 同时，在１９６２年由Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ和Ｓｋｏｏｇ为培养烟草细胞而设计的ＭＳ培养基，和在１９６８年由ＧａｍＢｏｒｇ 等为培养大豆根细胞而设计的Ｂ５培养基，是大家广泛使用的基础培养基． １材料与方法 １．１实验材料 １．１．１ 拟南芥生态型Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ（简称ＷＳ）种子为实验材料． １．１．２ ＭＳ培养基和Ｂ５培养基（见表１）． １．２实验步骤 １．２．１拟南芥幼苗的培养．拟南芥种子经表面（７５％乙醇，３０ｓ；无菌水洗４次）和深层（１０％次氯酸钠４ ｍｉｎ，无菌水洗３次）消毒后，用移液吸取拟南芥种子和水的混合物均匀地在不加任何生长调节物质的 无菌的ＭＳ生长培养基（Ｍｕｒａｓｈｉｇａ＆Ｓｋｏｏｇ盐和维生素，ｐＨ用ＮａＯＨ调至５．８，含６％琼脂）的平面上滴 落，并使之成为两条平行线，在超净台上吹干水分，再将培养瓶于黑暗中，２５℃条件下培养．待下胚轴长至 ８～１０ ｃｍ时为宜． 收稿日期：２００８．１１ １２ 通讯作者：陈彦，Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｙａｎｌ＠ｌｃｕ．ｅｄｕ．ｃａ 第１期 孙哲等：不同铁盐对拟南芥下胚轴愈伤组织诱导的影响 ５３ １．２．２培养基的配制．配制Ｂ 培养基和改良的四种Ｂ 表１培养基的组成 培养基，改良Ｂ 的培养基中铁盐分别为ＦｅＣ１，、ＦｅＣ１：、 Ｆｅ （ＳＯ ），、ＦｅＳＯ 及柠檬酸铁的Ｂ 培养基，其它成分与 Ｂ 培养基的组成成分相同（见表１）． １．２．３愈伤组织的诱导．在无菌平皿中将拟南芥无菌 苗的下胚轴切成约０．５ ｃｍ长的小段作为外植体，接种于 配制好的Ｂ 及改良的Ｂ 培养基上，每个培养瓶中接种 ３～５段，每种培养基接种６瓶，封口后，于２５℃黑暗条件 下培养，进行下胚轴愈伤组织的诱导，每天观察其生长 注：表１：Ｂ５：Ｂ５及改良的Ｂ５培养基．＋代表含有Ｋ１，铁 情况（见表２，３）． 盐含量与Ｂ５中的相同（０．１ ｍｍｏｌ・Ｌ－１）． ２实验结果与分析 接种４～５ ｄ后，从切段切口处开始长出肉眼可见的 淡黄色愈伤组织，１０ ｄ后，对比各培养基上愈伤组织的生长情况． 表２ 伤组织的诱导 表３ 不同铁盐对拟南芥下胚轴愈伤组织诱导的影响 培养基 夕 诱导率 铁盐成分 总数 个数 Ｂ５ Ｆｅ—ＥＤＴＡ ２６ ２２ ８４．７％ （Ｂｓ）１ ＦｅＣ１３ ２５ ２０ ７９．６％ （Ｂ ）， ＦｅＣ１２ ２５ １５ ６０．２％ （Ｂ５）３ Ｆｅ２（ｓ０４）３ ２Ｏ ｌ５ ７５．４％ （Ｂ５）４ ＦｅＳＯ４， ２０ １６ ８０．１％ （Ｂ５）５ 柠檬酸铁 ２８ ２４ ８５．９％ 注：表中诱导率％是３次重复的平均值． 注：表中数据是３次重复的平均值，显著性水平Ｐ＜０．０５ 比较以上结果可知，Ｆｅ—ＥＤＴＡ、ＦｅＣ１３、ＦｅＣ１ 、Ｆｅ２（ＳＯ ）３、ＦｅＳＯ 和柠檬酸铁都能诱导拟南芥下胚轴产 生愈伤组织，其中诱导率最高和最低的，分别是加有柠檬酸铁的Ｂ 培养基和加有ＦｅＣ１：的Ｂ 培养基，它 们的诱导率分别是８５．９％和６０．２％． 通过对愈伤组织诱导率的方差分析和愈伤组织状态的观察，我们可以得出：柠檬酸铁更有利于愈伤组 织的形成，且愈伤组织产生时间早，结构致密，体积膨大，质量较高；ＦｅＣ１ 不利于愈伤组织的形成，愈伤组 织质量差．并且可以得出物种铁盐对愈伤组织诱导的促进作用由大到小依次为柠檬酸铁＞Ｆｅ—ＥＤＴＡ＞ ＦｅＳＯ ＞ＦｅＣ１ ＞Ｆｅ：（ＳＯ ） ＞ＦｅＣ１：，即：以柠檬酸铁替带Ｂ 培养基中的Ｆｅ—ＥＤＴＡ更有利于拟南芥下胚 轴产生愈伤组织． ３ 实验讨论 ３．１无菌莳培养 在培养无菌苗时，以不添加任何生长调节物质的ＭＳ固体培养基为培养基质．实验发现，琼脂含量对 种子萌发和幼苗生长的影响很大．我们分别用５％、６％、７％的琼脂的培养基做种子萌发试验，发现在琼脂 含量为５％的培养基中，部分种子烂掉；在含７％琼脂的培养基中，种子能够萌发，但胚根很难进入培养基； 而含６％琼脂的培养基中，种子萌发和幼苗生长状况良好．同时在黑暗条件下培养无菌苗有利于幼苗快速 长高，获得足够多的外植体材料． ３．２铁盐在愈伤组织诱导中的作用 铁是植物生长的必需微量元素．在组织培养中，所有的培养基都含有铁，只是其存在形式不完全相同． 添加不同铁盐的Ｂ 培养基中，铁盐以柠檬酸铁形式存在的培养基上，下胚轴愈伤组织的长势最好．说明柠 聊城大学学报（自然科学版） 第２３卷 檬酸铁是诱导拟南芥下胚轴的最佳铁供应源． ３．３愈伤组织的诱导 在拟南芥组织培养中，愈伤组织及体细胞胚胎发生、发育受多方面的影响，包括生理 ．７ｊ、形态 ｊ、生 化［９ 等因子，其中营养成分（大量元素和微量元素）、植物激素和基因型是关键的制约因素，植物体细胞胚 胎发生过程中，在外植体培养的初期，植物组织处于感受态，极易接受诱导信号，导致进一步愈伤组织的产 生和体细胞胚的形成．本研究中，不同铁盐对外植体产生愈伤组织的能力是不同的，拟南芥下胚轴的愈伤 诱导率最高而且所需的时间最短，并且产生的愈伤组织大多数为胚性愈伤组织，这说明了下胚轴具有很强 的脱分化能力．另外，不同铁盐所产生的效应不同，在改良Ｂ ＋柠檬酸铁的作用下，外植体产生愈伤组织 的趋势较强． ３．４愈伤组织的状态 来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异．例 如它们的颜色可能或是黄或是白；它们的外观可能或是光滑或是粗糙；它们的结构可能或是致密或是松 脆；它们的遗传生理功能可能或是具有胚性，或是不具有胚性．在不同的实验中由于目的不同，对愈伤组织 状态的要求也不完全相同，但优良的愈伤组织通常必须具备一下４个特性：（１）旺盛的自我增殖能力，以 便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系．（２）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮 系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。（３）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得 到再生植株．（４）经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作． 我们还将愈伤组织转接到诱导芽的培养基上．一周后发现，原来铁盐以柠檬酸铁形式存在的培养基 上，下胚轴愈伤组织的长势最好，在诱导芽的培养基中生长得也旺盛．也就是说，愈伤块呈黄色，且质地坚 硬，生长旺盛，这将为今后由愈伤分化成植株提供较好的基础．这也说明了，柠檬酸铁也是诱导拟南芥芽 的最佳铁供应源，但由于时间有限，未能诱导出芽． 参考文献 ［１］曹恭，梁呜早．铁一平衡栽培体系中植物必需的微量元素［Ｊ］．土壤肥料，２００３，（４）：４６～４７． ［２］章艺，史锋，刘鹏，等．土壤中的铁及植物铁胁迫进展［Ｊ］．浙江农业学报，２００４，１６（２）：１１Ｏ～１１４． ［３］［日］高井康雄．植物营养技术［Ｍ］．北京：农业出版社，１９８８． ［４］谭文登．观赏植物组织培养技术［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９１ ［５］楼程富，本问慎，久野胜治．添加铁、锰及镉对桑愈伤组织生长的影响［Ｊ］．蚕业科学，１９９４，２０（１）：７—１１． ［６］ 陆建英，杨晓明，马瑞君．青藏高原东缘鹅绒委陵菜种群克隆结构的研究［Ｊ］．草业学到报，２００８，１７（２）：６８～７４． ［７］Ｄｅ Ｊｏｎｇ Ａ Ｊ，Ｓｅｈｍｉｄｔ Ｅ Ｄ Ｌ．Ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔ Ｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，２２：３６７～３７７， ［８］Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ Ｊ Ｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｇｈ ｐｌａｎ［ｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９３，５：１ ４１１—１ ４２３ ［９］Ｅｍｏｎｓ Ａ Ｍ Ｃ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｂｏｔａｎｉｅａ Ｎｅｅｒｌａｎｄｉｃａ，１９９４，４３：１～１４． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｉｒｏｎ ｏｎ Ｃａｌｌｕｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｏｆ Ａ Ｒａｂｉｄｏｐｓｉ Ｓｔｈａｌｉａｎａ ＳＵＮ Ｚｈｅ ＣＨＥＮ Ｙａｎ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｉＬａｏｃｈｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＩＪａｏｅｈｅｎｇ ２５２０５９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉａｏｏｈｅｎｇ Ｕｎｉｅｒｒｓｉｙｔ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ ２５２０５９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｆｅ－ＥＤＴＡ，ＦｅＣ１２，ＦｅＣ１３，ＦｅＳＯ４，Ｆｅ２（ＳＯ４）３ａｎｄ Ｆｅ（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）・ＸＨ２Ｏ（Ｆｅｒｒｉｃ ｃｉｔ— ｒａｔｅ）ａｓ ｓｏｕｒｃｅｓ，ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＫＩ ｉｎ Ｂ５ ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｏｆ Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓｔｈａｌｉａｎａ ａｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｆｏｒ ｔｗｏ ｗｅｅｋｓ．Ｃａｌｌｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｅｖｅｒｙ ｋｉｎｄ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ．ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔ ｉＳ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｆｅｒｒｉｃ ｃｉｔｒａｔｅ ａｓ ｓｏｕｒｃｅｓ．Ｉｔ ｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂ５ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ Ｆｅｒｒｉｃ ｃｉｔｒａｔｅ ｉｎ ｓｔｅａｄ ｏｆ Ｆｅ—ＥＤ－ ＴＡ ｉｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓｔｈａｌｉａｎａ，ｃａｌｌｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ。ｉｒｏｎ
