荧光原位杂交FISH实验步骤与方法

FISH实验步骤

一、实验仪器：

荧光显微镜:

高速离心机：可达12000r/min 高压灭菌锅：160℃以上杀菌 恒温箱：为杂交提供恒定温度 恒温水浴锅

照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片

二、试剂的配制：

1、0.2mol/ L (pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB) 试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。

-----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解

-----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解

----0．2M (pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB) : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合

高压灭菌，常温保存。

2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）

试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB

------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB) ，加蒸馏水至1000ml，混匀

------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml ------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml 高压灭菌，常温保存。 3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作） -----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃，

------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃ -------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。 -------1/3体积的PBS溶液，

-------用Hcl将pH调至7.2，定容， -------用孔径为0.22μm的滤膜过滤，

----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。

（加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。

4、1mol/L(pH8.0)Tris-HCl缓冲液的配置

---121.1g Tris(三羟基氨基甲烷), 加800mL蒸馏水溶解，加入大约42mL的浓HCl ---用1M的HCl或lM的NaOH将pH调至8.0，最后加蒸馏水至1000Ml 高压灭菌，4℃冰箱保存。 5、10%SDS

---10g SDS（十二烷基硫酸钠）于50ml灭菌水中，加水至100ml，分装后室温保存。灭菌，或用滤膜过滤

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称取SDS时需戴口罩！

6、0.5M EDTA（pH8.0）溶液的配置

---- 186.1g乙二胺四乙酸二钠 加800mL蒸馏水溶解，剧烈搅拌(最好使用磁力搅拌机) -----用NaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至1000mL。 7、杂交缓冲液

配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序：

360μL 5M NaCl； 40μL 1MTris—HCl

xμL 100％甲酰胺（见下表） yμL 无菌水（见下表） 2μL 10％SDS

0.22μm孔径的滤膜过滤，4℃保存。

表1 配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积

甲酰胺浓度（%）

甲酰胺体积x（μL）

无菌水体积y（μL）

1598 1498 1398 1298 1198 1098 998 8 798 698 598 498

0 0 5 100 10 200 15 300 20 400 25 500 30 600 35 700 40 800 45 900 50 1000 55 1100

（甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收）

不同甲酰胺杂交液的配制

甲酰胺浓度5M NaCl溶液 1M Tris-HCl 10% SDS 甲酰胺体积x（%） （mL） (mL) (mL) （mL） 20 72 8 0.4 80 35 72 8 0.4 140 40 72 8 0.4 160 55 72 8 0.4 220 8、杂交后洗涤液的配置

配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下： Z μL 5M NaCl

1mL 1MTris-HCl(pH7.6) 无菌水加至50mL 50μL 10％SDS

无菌水体积y（mL） 239.6 179.6 159.6 99.6

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500μL EDTA

表2 根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而定的探针清洗液液中NaCl体积数

甲酰胺浓度%

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

NaCl体积z（μL）

9000 00 4600 3280 2250 1590 1120 800 560 400 280 200

NaCl最终浓度（mM）

900 0 460 328 225 159 112 80 56 40 28 20

不同甲酰胺对应的洗涤液的配制

甲酰胺浓度（%） 20 35 40 55 1M Tris-HCl (mL) 8 8 8 8 10% SDS (mL) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5M EDTA （mL） 4 4 4 4 5M NaCl溶液 （mL） 18 6.4 4.48 1.6 无菌水体积（mL） 369.6 381.2 383.12 386

9、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI)

常备：1 mg µl

-1

需要稀释为：1 µg µl

灭菌储存在-20℃ (用铝箔覆盖管子)

DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。

为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。

-1

三、实验步骤：

1、玻片的预处理：

（1）玻片预处理

1）玻片清洗：

载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，在实验室可用超声清洗代替刷洗（4~5次 每次10 min），然后用清水浸泡过夜； 2）硅化处理：

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第二天换用1%的盐酸浸泡24小时，然后用蒸馏水清洗干净后放入高压灭菌锅灭菌，60°C烘干。盖玻片用锡纸包好4°C保存备用。（盖玻片干净即可，不用处理）

(2)黏附剂涂片制备

载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液（现配现用）中约1min，取出用高压灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥（也可放入烘箱里25°C烘干），然后置4℃保存备用

2、荧光探针的选择和标记（见fish探针的选择表） 3、样品的制备与固定

（1）用已灭菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液1mL，加适量灭菌蒸馏水振荡混匀，并用超声波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约 0.5ml进行后续处理。 （2）将悬浊液混合均匀后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4℃固定24小时，

（3）然后置于12000r/min离心5min去除固定剂，将固定样本加入1ml 0.0lmol/L PBS以10000r/min的速度离心漂洗两次，弃去上清液。 （4）采用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于−20℃保存备用

4、样品的预处理

（1）用微型振荡器将样品混合均匀，取10μl样品在载玻片上涂抹20mm×20mm大小（不要太大），37℃的烘箱热固定2h，最高温度不超过60℃

（2）风干后于50％、80％、95％的乙醇中各脱水3min，自然风干。

（脱水：准备三个瓷盘，然后将载玻片取出依次放入瓷盘中，用50%乙醇淹没载玻片，脱水3min，取出放入第二、三个瓷盘，然后用80%乙醇脱水，96%乙醇脱水。脱水后的80%、96%乙醇回收。）

脱水后的玻片可以在室温下保存几个月，可在-20℃的条件下保存几个月 5、原位杂交

探针浓度为50ng/μL，

在密闭的杂交盒内铺满吸水纸（经高压灭菌烘干），用杂交液湿润，使杂交环境保持一定的湿度。用移液分别取24μL的杂交液和1μL探针滴入带有样品的载玻片上（均匀覆盖涂片面积），（加盖硅化盖玻片，不用）放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间如下。

所有有关探针的操作在处理时都应避光处理！ 探针种类 EUB MIX AOB MIX NOB MIX GAO MIX HGC69a PAO651 温度（℃） 46 46 46 46 46 46 时间（h） 5 3 5 2.5 2.5 2.5 甲酰胺浓度% 20 55 40 30 30 30 备注 同步染色法 重复染色法 重复染色法 同步染色法 同步染色法 同步染色法

6、杂交后洗涤

从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48℃的水浴中预热20分钟。杂交完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特异性结合的信号，增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片，清洗15～20分钟后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室温下晾干。 7、DAPI染色

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每个玻片用10μL DAPI（用甲醇稀释至1μg/μL）滴加到载玻片样品上，在冰上染色10min，用水冲洗多次，室温下自然晾干，镜检前加盖盖玻片。 8、荧光显微镜观察

经过以上处理的样品，用荧光显微镜进行观察。 探针 EUB338 NIT3 cNIT3 GAOQ9 HGC69a PAO651

a

目标菌群 探针序列 GCTGCCTCCCGTAGGAGT CCTGTGCTCCATGCTCCG CCTGTGCTCCAGGCTCCG TTCCCCGGATGTCAAGGC TATAGTTACCACCGCCGT CCCTCTGCCAAACTCCAG CGGGAGGCAGCAGT

甲酰胺浓度

20% 55% 40% 35% 25% 35% 35%

修饰 HEX HEX FITC Cy5 FITC Cy3 FAM

TMTM

Domain Bacteria

NSO190 Ammonia-oxidizing bacteria CGATCCCCTGCTTTTCTCC

b

Nitrite-oxidizing bacteria

Competibacter Actinobacteria Accumulibacter Denitrifier

b

注：探针浓度均为50ng/μL；cNIT3为菌探针NIT3的竞争探针。

Abbreviation FITC（绿色） DAPI（蓝色） 365 nm CY3（橙色/红色） CY5（红外线检测） HEX 5 nm 650 nm 418 nm 570 nm 667 nm 15(Zeiss) 26(Zeiss) maximum absorption Maximum emission 492nm 528nm Filter set 10(Zeiss) 02(Zeiss)

探针的选用

选用EUB MIX(EUB338、EUB338Ⅱ、EUB338Ⅲ)来检测活性污泥中的全部的细菌。 选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌，

选用AOB MIX NOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。 选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌，

选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria，

用PAO651来检测优势菌种Rhodocyclus，杂交后用4¢ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydro-chloride (DAPI) (1:1,000稀释)和PHB进行 复染样品。

试剂与材料：

NaH2P04·2H20，Na2HP04·12H2O； NaCl；

多聚甲醛PFA；

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150g三羟基氨基甲烷 (Tris)，浓HCl，NaOH； 十二烷基硫酸钠（SDS）； 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）； 100％甲酰胺； DAPI；

载玻片，盖玻片，吸水纸，瓷盘（带盖）；

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