人血浆中非布司他的测定方法-LC-MS解读

及其药动学应用

摘要：一种改进的、简单的高度敏感的LC-MS/MS测定非布司他的方法已经建立，根据监管指南在100毫升人血浆中使用febuxostat-d7作为内标（IS）验证。用乙醚液液萃取从人的血浆中提取分析物和内标。色谱分离是在用混合乙腈和5Mm/L的甲酸铵(60:40, v/v)作为流动相，流速为0.5mL/min的C18烷硅胶柱上实现的。总流动时间为5.0分钟，非布司他和IS的洗脱分别发生在1.0和1.5分钟。线性响应函数的浓度范围在1-6000ng/mL(r>0.99)。非布司他和内标的离子检测前体分别为m/z 317.1→261.1 和 324.2→262.1。日内和日间精密度(%RSD)分别在1.29–9.19%和2.85–7.69%范围内。上述方法已成功与用于人的药代动力学研究。 关键词：非布司他；人血浆；LC-MS/MS检测方法；药代动力学

前言

非布司他（图一），化学名为2 -[ (3 - 氰 基- 4 - 异丁氧基) 苯基]- 4 - 甲基噻唑- 5 - 甲酸，是一种新型的选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂，被用作高尿酸血症和痛风的治疗（恩斯特和福瑞威尔，2009）。根据血清和尿液中黄嘌呤氧化酶浓度的增加和尿酸水平的下降可证明其对黄嘌呤氧化酶有抑制作用，并且在嘌呤总量上缺乏显著性差异。，2008 年在欧盟获得批准上市，美国FDA 也于2009 年批准其上市。 近日，有一个LC-MS和一些LC-MS/MS方法检测生物样品中非布司他的报道。最近Lukram et al（2012）用于非布司他人血浆样品检测的UPLC-MS/MS灵敏度不足以用于生物等效性的研究，因为这种方法的定量下线偏高(LLOQ; 75 ng/mL)血浆体积也偏大（500μL）。Ding et al（2012）报道了一种小鼠血浆的LC-MS检测方法，用咪达挫仑做内标定量下线可以达到10 ng/mL。Wang et al.（2013）描述了一种用LC-MS/MS检测人血浆样品中非布司他的方法，该方法的定量下线可达10 ng/mL，可以支持人体的药代动力学研究。作者在这种方法中用了febuxostat-d7作为内标。这两种方法(Ding et al., 2012; Wang et al., 2013)都需要用蛋白沉淀法对样品进行处理，这可能会导致离子抑制，因为这种方法不能有效地去除内源性物质如脂类、凝脂和脂肪酸(Nováková and Vlcková, 2009; Van Eeckhaut et al., 2009;Kole et al., 2011).。报道的定量下线LLOQ (10 ng/mL)在给药后的16小时不能定量检测到。任何药物的给药后定量，在末期增加时间点对于获得重要药动学参数至关重要。为了克服这些缺点，在目前的工作中，我们开发并验证了一个LC-MS/M S方法，在人血浆中(100 mL)非布司他的定量下线可以达到1 ng/mL。在样品准备的过程中，为了使分析过程中得到更干净的提取物，我们还使用了一个简单的液液萃取技术，同时使用febuxostat-d7作为内标来避免潜在的基质效应在分析物和内标的回收率所关联的问题和差异。通过建立灵敏度高于十倍的LC-MS/MS方法，我们可以在人类志愿者体内给药30小时后定量检测非布司他。经验证的方法成功的运用于南印度男性受试者口服80mg非布司他后定量测定非布的司他的浓度的临床药动学研究。

图一。非布司他和非布司他-d7 用到的缩写：LLE,液液萃取

实验

化学药品与试剂

非布司他（纯度99.5%）由Apotex Pharmachem India Pvt. Ltd (Bangalore, India)提供。非布司他-d7(纯度99.2%, Fig. 1) 从Apotex Inc. (多伦多, 加拿大)获得。所用的高效液相色谱级乙腈由特里贝克(印度孟买)生产和高效液相色谱级的乙醚由RCl Labscan(海得拉巴,印度)生产。甲酸铵从默克有限公司采购 (印度孟买)。所有其他化学物质/试剂是研究级别的并且使用前未经纯化。

LC-MS/MS分析所使用的水是用Millipore (印度班加罗尔)生产的Milli-Q水净化系统净化的水。用从Deccan’s Pathological Laboratory (Hyderabad, India)获得的K2EDTA作为抗凝剂控制人血浆并于-30℃储存。

LC-MS/MS的设备与条件

一套安捷伦HPLC1200串联系统（安捷伦科技，USA）包括研究用到的一个四元液相泵，一个自动进样器和一个在线脱气设备。分析物和内标是在SB-C18(74.6mm, 3.5 mm)色谱分离柱内分开，分析柱是由甲酸铵和乙腈(40:6 0,v / v)等度洗脱的流动相组成的5毫米长，流速0.5毫升/分钟的流量。自动进样器温度维持在4 0C，进样量10毫升。总色谱运行时间是5分钟。通过使用一个配有Turboionspray™550 oC接口的MDS Sciex api-4000质谱仪(福斯特城、CA, USA) MS-MS在正离子模式下检测分析物来定量。离子源电喷雾压：5500 v . 参数源为喷雾器气体(GS1)、辅助气体(GS2),气帘气和碰撞气体被设定为25，25，15和2平方英寸。质谱参数有,去簇电压，碰撞能，入口电压和碰撞池出口电压对非布司他分别为80,25，10和15V，内标的分别为80，25,10和15 V。非布司他母离子及子离子m /z 317.1 /261.1，内标的母离子及子离子的m /z 324. 2 /262.2。解析度开始于四级子的Q1和Q3。保压时间是300毫秒。使用分析软件 (1.5.1版本)分析获得的数据。

标准血浆和质控的制备

主要储备液，非布司他(800毫克/毫升),内标(100毫克/毫升是在在甲醇制备的。通过适当的稀释解决校准和控制的工作溶液，乙腈和水(50:50,v / v;作稀释剂)。通过储备液稀释得到内标的工作溶液(2000ng/mL)。我们发现非布司他和内标的储备液在2-8oC 14天内稳定。 标准样品制备通过 K2 . EDTA控制分析物标准溶液制备所需要的人血浆，获得非布司他浓度为1.00,2.00,5.00,20.0,200,400,1200,2400,3600、4800和6000ng/mL的每一批的浓度点。同样质控（QC）样品制备成一定体积的溶液也是基于非布司他的独立权重，每一批的浓度点为定量下线的浓度为1.00，质控下线3.00，中浓度质控3000，高浓度质控4200ng/mL。内标和控制样本(100毫升)在聚丙烯管(Tarson,5毫升)中等分，并在分析前存储在-30±10℃的冰箱里。

样品处理

用简单的液液萃取来提取人血浆中的分析物和内标。分析之前，允许在室温下解冻所有冷冻样本,标准样品和QC样品。样品在进样之前需我选10S。100ML的人血浆样品与100ml的内标工作溶液febuxostat-d7 2000 ng / mL)混匀。加入100ml 0.1%的甲酸，涡旋十秒，加2.5ml乙醚用Dispensette Organic (品牌GmbH,韦特海姆,德国). 样品使用往复式摇匀机摇10分钟(Scigenics生物科技、金奈、印度),然后在4000 rpm离心6分钟，Megafuse 3 sr(Heraeus、

德国)。上清有机层转移到5ml玻璃试管中，40摄氏度液氮吹干。干提取物用400ul流动相复溶，取10ml上述溶液于LC-MS/MS系统进样。

生物样品分析方法验证

该方法验证根据FDA指导进行（US DHHS et al.,2001）。考虑（优化）了一系列的因素，包括选择性，特异性，灵敏度，基质效应，线性，精密度，准确度，回收率，稀释倍数和稳定性。通过比较10个不同来源的10个不同批次的空白血浆的色谱图的比较来评估方法的选择性，包括一个浑浊指数和溶血血浆。可以评估存在潜在干扰的常用药物咖啡因，尼古丁，泮托拉唑，布洛芬，对乙酰氨基酚，苯海拉明，伪麻黄碱和双环胺的干扰。灵敏度可以通过分析六个添加有标准曲线的最低浓度的相同血浆样品来判断。基质效应可以用六组含有不同 K2 . EDTA的血浆来检查。用六种不同的血浆，每种血浆分别制备LQC和HQC各三个（一共36各质控样品），和相同浓度的标准溶液替换进样。基质因子的整体精密度用变异系数（CV）来表示。

基质离子存在下的峰响应比（）内标

基质效应= 分析物

没有基质离子的峰响应比（）内标分析物

线性标准的验证，标准曲线至少需要十一个点（非零标准）。另外，要分析空白血浆来验证

没有直接的干扰。为了验证日内精密度和准确度我们需要在同一天内分析一条标准曲线，LLOQ,QC,LQC,MQC和HQC分别的重复的六个样品。日间精密度和准确度需要在三个连续日内分析四批样品来确定。分析物和内标的回收率，通过提取标准分析物的峰面积与未经提取的标准分析物的峰面积之比来决定。非布司他的回收率用(LQC)3.00，3000(MQC)和4200（HQC）ng/ml来浓度来确定,稀释倍数是在可接受的准确度和精密度的范围内来增大上线浓度。每个浓度的样品六个，是标准曲线最高浓度的1.5倍，用空白血浆稀释2-4倍。稀释的样品处理后进样。

稳定性试验是为了评价不同储备溶液和血浆样品在不同条件下分析物的稳定性。储备液在室温和冻融条件下（2-8 ）的稳定性，通过比较分析物的峰面积（稳定性样品）与新制备的储备液样品的峰面积来确定。最高实验过程中的稳定性（23h），处理后样品稳定性（自动进样器104h内稳定，重复进样24h内稳定），冻融稳定性（三次冻融），长时间稳定性（40天），在LQC和HQC的浓度进行测试，每个浓度水平六个重复样品。样品分析值的准确度（ 15% SD）和精密度(≤15% RSD)在可接受范围内认为稳定。

药动学研究设计

在八个健康男性志愿者进行了药动学研究。伦理委员会(生命线伦理委员会,班加罗尔,印度)批准了临床试验方案，志愿者也提供了书面同意书。志愿者在执行给药方案前需禁食12h。血浆样品采集时间为口服80mg非布司他片的，服药前和0.25，0.50，0.75,1.0,1.5,2.0,3.0, 4.0，5.0，6.0,7.0,8.0,10.0,14.0,24.0和30.0小时，用加有K2 . EDTA的一次性血液采集管(BD, Franklin, NJ, USA)。采集管需在3000rpm下离心十分钟，采集血浆。采集的血浆在使用之前应该保存在-30 10 条件下。血浆样品需添加内标根据前述的提取步骤处理样品。非布司他的血浆药时曲线关系是用WinNonlin Version 5.非房室方法分析的 。一个样品的再分析是通过选择接近Cmax和消除相的12个志愿者样品（每个志愿者选两个样品）。数值的改变百分比不能超过

结果和讨论

质谱

质谱参数包括电喷雾离子所用的正离子和负离子模式。虽然非布司他包含了一个氮原子（正质子受体，）也包含了一个功能羧基（质子供体），我们发现质谱响应在正离子模式下比阴离子模式下高。分析物和内标的离子模式[M + H]+离子在Q1范围内为母离子，在Q3作为先导离子获得离子光谱。非布司他质子跃迁最大在m/z 317.1261.1范围内，而内标则最大在324.2——262.1范围内。每次跃迁的驻留时间是300ms。LC-MRM对于药动学的研究是一种重要的技术，它为分析方法提供了选择性和灵敏度高的仪器(Karra et al., 2012)。因此，MRM技术被用来发展分析。MRM的状态参数是在一个100ng/ml的浓度状态下来时非布司他的响应最大化。

方法建立

方法建立包括流动相，流速，分析柱的类型和进样体积的优化。分离是在尝试在不同的C8和C18柱中用有机溶剂如乙腈和甲醇的不同体积比，再加入缓冲液甲酸铵和乙酸铵，加入甲酸和乙酸的不同强度作为酸添加剂。值得注意的是5毫摩尔的甲酸铵和乙腈(40:60, v/v)作为流动相最合适，能得到最好的灵敏度，效能和峰形。SB-C18 (74.6 mm,3.5 mm)液相分离柱在分析物最低的浓度范围内也能得到很好的峰形和响应。流动相的流速为0.5 mL/min。ART和IS的保留时间分别为1.00和1.50分钟。整个色谱图的运行时间为3.5分钟。

最初的提取方法,固相萃取(使用绿洲HLB或俄耳甫斯C18墨盒)和蛋白质沉淀(使用乙腈等有机溶剂,甲醇和乙醇)都进行了测试。获得的回收率实验结果不一致，特别是在定量下线的浓度时，两次的情况色谱结果都很差。因此，考虑用液液萃取使用乙醚,甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷等溶剂单独萃取和在酸性条件下联合萃取。液液萃取更能获得一个符合色谱条件的更干净的样品，并可以避免非挥发性材料引入色谱柱和质谱系统。在LC-MS /MS中较清洁的样品对于减少离子抑制和基体效应至关重要。基于单独用不同溶剂和联合使用的适用性检查，发现乙醚是最佳选择，它可以在一个空白样品中得到一个清晰的色谱图，并使血浆中分析物的回收率最高。在血浆样品中添加不同体积比的甲酸可以帮助获得一个较一致且可重现的响应。利用稳定的同位素标记的分析物作为内标，可以在生物样品分析中增加分析物和内标的分析精密度并限制多变的回收率。(Viswanathan et al., 2007; Gajula et al., 2013)。同样，对于LC-MS/MS的分析，当有显著的基质效应时，稳定的同位素标记的化合物作为内标对避免基质效应很有用。在这些工作的初期阶段，我们考差了几个化合物，为了找出一个合适的内标，最后发现一个非布司他的稳定的同位素标记物非布司他d7对于目前的目的是最好的。

选择性和色谱分析方法

方法的选择性是通过分析空白人血浆提取物和只加有内标的提取物来确定的。如图(2a)所示，在不含药的人血浆中分析物和内标的保留时间处空白血浆中的内源性物质没有干扰。同样地，图2（b）显示了MRM渠道分析时，内标没有直接的干扰物。图2(c)描绘了一个LLOQ (1毫微克/毫升)代表性离子色谱图样本。同样，没有观察到常用药物如咖啡因、尼古丁、泮托拉唑、布洛芬、对乙酰氨基酚、苯海拉明、伪麻黄碱和双环胺的干扰(数据未显示)。图2（d）显示了单剂量口服给药非布司他80mg后分析人血浆样品的结果的一个代表性的色谱图。

基质效应

基质效应评估是为了检查不同血浆在两种不同的质控浓度水平（LQC和HQC）对离子增强/抑制的效果。六个组的空白生物基质包括脂血症的和溶血症的都要做一式三份的低浓度和高浓度质控，与未经处理的同浓度的标准样品交叉进样进行比较。基质效应的整体精密度可以用CV，在LQC时为6.31，在HQC时为4.23。基质效应的值高于100%则指示为增强作用，

若低于则指示为抑制作用。

a. m/z: 317.1/261.1 m/z: 324.2/262.1

b m/z: 317.1/261.1 c

m/z: 317.1/261.1 m/z: 324.2/262.1

m/z: 324.2/262.1

d m/z: 317.1/261.1 m/z: 324.2/262.1

图2.非布司他的典型多反映检测图谱（左侧板）和内标（右侧板）在人空白血浆中（a），(b)人血浆中添加了内标。（c）添加了内标的定量下线样品。（d）单剂量口服给药80mg非布司他片0.75小时的人血浆样品(1742 ng/mL)。

图3（a）基质效应-离子抑制

图3. （b）内标的基质效应

离子抑制基质效应也可以通过注射空白溶液来评价，不同组的空白血浆（含K2EDTA的空白血浆，包括脂溶性的和溶血性的）提取空白基质然后混入标准药物。有分析物和内标的六批人血浆样品没有发现明显的基质效应(Fig. 3a,b).同样，提取方法很稳定当应用到人血浆样品分析时，得到了明确的、一致的结果。

灵敏度

分析物最低的可信定量限被设定为定量下线的浓度。定量下线浓度时分析物的精密度和准确度分别为3.16%和114.33%。

滞留效应

滞留的评估是为了确保它不会影响计划用的方法的准确度和精密度。注射最高浓度的样品后再进空白样品，没有观察到明显的滞留效应（ULQ;定量上限），说明了在随后的样品中没有残留物（数据没有显示。）

线性，精密度和准确度

十一个浓度点的标准曲线可以使非布司他的浓度范围在线性范围内（1.00–6000 ng/mL）。在比较了两个权重模型(1/x and 1/x2)后，药物到内标浓度的权重因子为1/x2的回归方程被发现能最好的反应出浓度与检测器响应之间的关系。在验证过程中加权标准曲线的平均相关系数为≥0.99。

QC血浆样品的日间和日内精密度和准确度的结果如表一所示。日内和日间精密度的偏差值在LQC，MQC和HQC时是在15%之内,LLOQ时是在20%之内。日内和日间准确度的偏差值在LQC,MQC和HQC时是在100 15%的真实值范围内，在定量下线时是100 20%范围内。结果显示了好的准确度和精密度。

提取率

分别制备在低，中，高质控浓度的非布司他样品六个来确定萃取回收率。用乙醚进行液液萃取很稳定，并能得到最干净的样品。非布司他的整体回收率在82.7±3.64%之间，精密度的范围是3.77-5.86%。内标的回收率88.5±0.75%，精密度的范围在3.54–4.72%内。内标和分析物的回收率很好并可重现。

稳定性和稀释倍数

在不同的稳定性试验中得出，试验中的稳定性（23h）,自动进样器稳定性（104h）,反复冻融实验（三次循环），重复进样稳定性（24h）,-30 时的长期稳定性为40天。分析物的品均百分标准值是在分析物的LQC和HQC浓度的预计浓度的15%以内。因此在整个方法学验证过程中，实验结果是在合格的。 通过用筛选的人空白血浆稀释2-4倍，非布司他的浓度上线可以延伸到9000 ng/mL。稀释1:2和1:4倍的样品的平均反运算浓度在他们的理论值的85–115%之间，且变异系数小于3.2%。

药动学研究

我们发现分析的灵敏度和特异性足够精确地描绘在给八个健康志愿者口服80mg非布司他后，人体非布司他的药动学特征。非布司他的平均血药浓度-时间曲线由图4显示。血浆中非布司他的最大浓度(Cmax) (5.21±0.80 mg/mL)，出现在0.91±0.27 h (tmax)的时间范围内。非布司他血浆浓度时间曲线下面积从0点到最后持续时间点(AUC0–t)，血浆浓度时间曲线下面积从0点到无线时间点(AUC0– )分别是15.1±3.56和15.1±3.57ugh/mL。最后的消除半衰期(t½)是4.23±0.69 h。在以前报道的方法中，所提交的数据没有明确说明非布司他的定量超过16小时后是否可信(Ding et al., 2012; Wang et al., 2013).。虽然以前报道的方法也用于人体药动学的研究，我们相信它可能会很容易地延伸到临床前研究物种的药动学研究。

图四.人血浆中非布司他平均±SD

在健康志愿者（n=8）口服给药非布司他（80mg片剂）血浆浓度时间曲线

研究样本再分析

为了评估经验证的LC-MS/MS方法的适用性，已研究样品需要被分析，用已研究样品的再分析程序和标准进行比较。(Fast et al., 2009; De Boer and Wieling, 2011)。已研究样品再分析是用每个志愿者的两个血浆样品，再用一个单独的批进样。所有测试样品的再分析数据与原始数据的浓度差应小于20%（表三），说明现有方法的重现性很好。 结论

总之，我们开发并验证了一个进步的，干灵敏度、高选择性的LC-MS/MS方法，根据指导原则测定了人血浆样品中非布司他的浓度。从所有方法学验证参数来看，我们可以得到如下结论，在理想的精密度和准确度下，现在的这个方法对于生物等效性研究和临床前药动学研究很有用。由于我们提高的这个方法的高灵敏度，我们可以定量人口服非布司他30小时的人血浆中的非布司他。 致谢

作者非常感谢Apotex Research Pvt. Ltd（印度班加罗尔)提供必要的仪器来完成这个实验。

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读书的好处

1、行万里路，读万卷书。

2、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。 3、读书破万卷，下笔如有神。

4、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的。——达尔文 5、少壮不努力，老大徒悲伤。

6、黑发不知勤学早，白首方悔读书迟。——颜真卿 7、宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来。 8、读书要三到：心到、眼到、口到 9、玉不琢、不成器，人不学、不知义。 10、一日无书，百事荒废。——陈寿 11、书是人类进步的阶梯。

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