口 口 口 口 叼 中西医结合心脑血管病杂志２００８年１１月第６卷第１１期 １３４ｌ ８７． ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，２００ｌ，３２（３）：６７５—６８０． Ｊｏｎａｔｈａｎ ＷＢ，Ｍａｒｓｈａｌｌ Ａ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇ，ｅｌ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ［１４］Ｌｅｅｓ ＫＲ，Ｂａｒｅｒ Ｄ，Ｆｏｒｄ ＧＡ，ｅｔａ１．Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＮＸＹ一０５９ ａｔ ｎｅｕｒ０ｐｒ０ｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｌｏｍｅｔｈｉａｚｏｌｅ，ＡＲ—Ｒ１５８９６ＡＲ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｅｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｒｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］． ＮＸＹ一０５ ９ ｉｎ ａ ｐｒｉｍａｔｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｔｒｏｋｅ ｕｓｉｎｇ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｅ— Ｓｔｒｏｋｅ，２００３，４（２）：４８２—４８７． ｈａｖｉｏｕｒａｌ￣ｅａｓｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，９７２：１１９—１２６． ［１５］Ｉｓａｂｅｌｌｅ Ｍ，Ｍｉｃｈｅｌ Ｐ，Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｉ ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｌｅｅｓ ＫＲ，Ｚｉｖｉｎ ＪＡ．ＮＸＹ一０５９ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］． ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏ Ｍｅｄ，２００５，３９：４２９— Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００６．３５４（６）：５８８—６００． ４４３． Ａｓｈｆａｑ Ｓｈｕａｉｂ ＭＤ，Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｒ，Ｌｅｅｓ ＭＤ，ｅｔ ａ１．ＮＸＹ～０５９ ｆｏｒ 作者简介：冯飞，现为南京巾医药大学２００６级硕士研究生（邮编： ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＳＡＩＮＴ—ＩＩ Ｔｒｉａｌ［Ｊ］．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ ２１００２９）；姜亚军，工作于南京中医药大学附属江苏省中医院。 Ｍｅｄ，２００７，３５７（６）：５６２—５７１． （收稿日期：２００８一Ｏ４—２８） Ｌｅｅｓ ＫＲ，Ｂａｒｅｒ Ｄ。Ｓｈａｒｍａ ＡＫ，ｅｔ ｎＺ．Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａ— （本文编辑王雅洁） ｃｏｋｉｎｅｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｔｒｏｎｅ ＮＸＹ一０５９ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｓｔｒｏｋｅ 变性高效液相色谱检测法在基因突变分析中的应用 杨文明，李瑞娟，鲍远程，汪瀚，汪美霞 中图分类号：Ｒ７３３．７ Ｑ５０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—１３４９（２００８）１１—１３４１—０３ 基因存在于染色体上，是遗传的基本结构和功能单位。基 点。基因突变可分为中性突变和病理性突变。前者不引起分子 因突变在生物进化及遗传某些疾病的发病中起着重要作用。目 表型蛋白质的结构和功能的改变，后者则会发生分子表型的改 前用于基因突变的检测技术主要有ＲＮａｓｅＡ切割法、变性梯度 变并引起疾病。突变可以发生在体细胞中，也可以发生在生殖 凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）、杂 细胞中。体细胞突变是不能遗传给后代的，但若发生在性细胞， 合双链分析法（ｈｅｔｅｒｏｄｕｌｅｘ ａｎａｌｇｓｉｓ，ＨＡ）、化学切割错配法 则可以引起遗传病。原癌基因若发生突变，则可引起细胞发生 （ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈ，ＣＣＭ）、单链构象多态性（ｓｉｎｇｌｅ— 不可控制的分裂，引起癌症 ｊ。基因发生自发突变的几率很低， ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）、切割片段长度多态 主要是由于嘌呤碱和嘧啶碱的不稳定性和ＤＮＡ复制的错误所 性（ｃｕｔｔｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＣＦＬＰ）、酶促切割错 致。诱发性点突变主要是由于环境中许多物理和化学因素（如 配、错配接合蛋白检测、等位基因特异性扩增、等位基因特异性 辐射、紫外线、烷化剂等）造成ＤＮＡ分子结构的损伤。按类型 寡核苷酸片段分析（ａｌｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳ（））、引物延 分，基因突变又可分为碱基取代（错义突变、无义突变、延长突 伸检测、寡核苷酸连接检测、限制性片段分析、ＤＮＡ芯片技术、 变）、缺插性点突变、非编码序列的点突变、ＤＮＡ重排等几种。 ＤＮＡ测序、变性高效液相色谱检测法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ— ２ ＤＨＰＬＣ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ，ＤＨＰＬＣ）等。ＤＨＰＬＣ是近年来 ２．１ ＤＨＰＬＣ工作原理 变性高效液相色谱又称为温度调控 发展起来的一一项相对较新的能够满足大规模基因变异检测筛查 的杂合双链色谱（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｃｈｒｏｍａ— 的技术 。１９９５年，Ｏｅｆｎｅｒ和Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ将这项技术推荐为用 ｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＭＨＣ），可在部分变性的温度下，通过离子反相高效 于突变检测的新方法Ｆ ２７ 。ＤＨＰＬＣ技术是一项在ＳＳＣＰ和 液相色谱技术检测到不完全匹配的杂合双链。ＤＨＰＬＣ技术最 ＤＧＧＥ基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术，其原理 先由Ｏｅｆｎｅｒ等［２ 于１９９５年建立。该技术使用的仪器设备是由 与ＤＧＧＥ类似，即通过ＨＰ１，Ｃ在部分变性的条件下可将发生错 ＨＰＩ Ｃ仪、ＰＣＲ仪、生物纳米材料吸附分离柱等组成。其原理 配的异源杂合双链ＤＮＡ和完全匹配的同源双链ＤＮＡ分离开 与ＤＧＧＥ类似，不同的是ＤＨＰＬＣ以ＨＰＬＣ这种精确度更高、 来。它具有廉价省时、节约劳动力、灵敏性高、特异性强等优点。 分离范围更大的色谱技术代替了ＤＧＧＥ中的凝胶电泳，在部分 】 基因突变 变性条件下，将发生错配的异源杂合双链ＤＮＡ与完全匹配的 基 是遗传的基本结构和功能单位，是存在于染色体上的 同源双链ＤＮＡ分离出来。 一段具有一定组织结构的双链ＤＮＡ序列。人类染色体的ＤＮＡ 在ＤＨＰＩ Ｃ系统，ＤＮＡ片段在液体缓冲剂中通过ＤＨＰＩ Ｃ 包含着１Ｏ万个左右的基闪。人类基因有大有小，平均约为（１．０～ 系统形成液体流动相。依据ＤＮＡ片段的大小分离ＤＮＡ片段 １．５）ｋｂ。基因具有遗传性及变异性双重性。 是通过ＤＮＡ色谱柱一ＤＮＡＳｅｐ柱系统（ＵＳＡ）流动相和固体相 所有生物的基【大ｊ组ＤＮＡ并不稳定，很容易发生各种各样 之间吸收或分区的差别完成的。ＤＮＡ片段的分离发生在分析 的改变而导致变异，其中一个很重要的变异形式就是基因突变。 柱。ＤＮＡ片段通过紫外线分光光度检测器检测，并且，模拟信 由于基闪突变涉及基 内一个或多个位点上的碱基的改变，故 号会转换成数值。结果会以色谱图的形式显示，也就是对应 也称为点突变。基闵突变具有稀有性、可逆性和多方向性等特 １）为安徽省科技攻关计划基金资助项目（Ｎｏ．０６０１３０５７Ａ） １３４２ ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡｌ ＯＦ ＩＮＴＥＧＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＯＮ ＣＡＲＩ）１０一／ＣＥＲＥＢＲＯＶＡＳＣＵＩ ＡＲ ＤＩＳＥＡＳＥ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８ Ｖｏ１．６ Ｎｏ．１１ ＤＮＡ片段的一系列波峰 。 ＤＨＰＬＣ进行突变检测的原理就是同源和异源双链ＤＮＡ 在柱上的保留不同。所有基因组ＤＮＡ的单拷贝均可通过ＰＣＲ 产生这些负面影响。为了提高ＰＣＲ扩增的保真性，ＰｆｕＤＮＡ聚 合酶常是优先选用的品种［ ，对于小于２５０ ｂｐ的片段，当ＰＣＲ 循环数与碱基数的乘积＜１０ ０００时，Ｔａｑ或Ｔａｑｇｏｌｄ聚合酶也 能获得保真性较高的ＰＣＲ产物。 ２．２．４ ＰＣＲ试剂 由于ＤＮＡＳｅｐ柱非常精密，也非常易损，对 反应大量扩增，杂合子个体的ＤＮＡ经扩增产生杂合二倍体，它 与纯合子个体的ＤＮＡ扩增产物一完全匹配的纯合二倍体的解 链特征不同。结合在柱上的ＤＮＡ分子由离子对试剂三乙铵醋 酸盐（ＴＥＡＡ）介导，被线性梯度的乙腈断开，从而导致ＤＮＡ从 许多常用的ＰＣＲ试剂均有一定要求。有些试剂在反应体系中 含量超过１Ｏ 时会对ＤＮＡＳｅｐ柱有损害，如牛血清白蛋白 （ＢＳＡ）。对普通ＰＣＲ缓冲液，常包含的某些成分也有限制。 ２．２．５分离温度 分离柱的温度改变会明显地影响ＤＨＰＬＣ 同定相向流动相移动，通过分析柱到达检测器。由于ＤＮＡ分 子带负电荷，而分离用色谱柱的同相呈电中性疏水性，因此 ＤＮＡ分子本身不能直接吸附到柱子上。而离子对试剂ＴＥＡＡ （ｉ乙铵醋酸盐）可以帮助ＤＮＡ分子与柱子固相填料表面分子 结合，其阳性铵离子可与ＤＮＡ相互作用，同时其烷基链又与柱 子的疏水表面相互作用，这样ＤＮＡ分子越长，结合的ＴＥＡＡ越 多，与固相结合得越牢固，越不易被洗脱，但羟基链与同相结合 的强度会随着流动相中乙腈浓度的增加而减弱。且大小相同的 片段其与柱子结合的难易程度也会因其序列不同而不同 。 ＤＨＰＩ Ｃ通过检测来自两种ＰＣＲ产物的包含错配序列核 苷酸的杂交双链鉴别突变和多态性。当野生型和突变型ＤＮＡ 在变性和退火时，序列变化产生了一系列混合的同源双链体和 异源双链体。这些混合的ＤＮＡ片段在部分变性温度下通过 ＤＨＰＬＣ分析，由于解链温度不同，异源双链通过线性的乙腈梯 度较同源双链更快的从柱上洗脱下来。因此，当非变性型（同源 双链）ＤＮＡ被分析时，色谱冈上观察到的是单峰；相反的，当分 析突变型（杂交双链）样本时，会出现２个或者更多的峰。 ＤＨＰＩ Ｃ可在非变性温度（４０ Ｃ～５Ｏ℃）条件下对不同长 度的双链ＤＮＡ进行分离，在部分变性温度（５ｌ℃～７ ℃）条件 下进行ＳＮＰ检测，在完全变性温度（７０℃～８ｏ℃）条件下对寡 核苷酸进行质量控制和纯化。可见，用ＤＨＰＩ Ｃ进行突变分析 是否成功，分析的温度起着至关重要的作用。因为同源和异源 双链ＤＮＡ在柱上保留的差别只有在部分变性的条件下才能被 观察到。不同的温度使得ＤＮＡ片段的保留时间改变。解链温 度（Ｔｍ）由解链曲线决定．突变检测的温度比解链温度低１摄氏 度。在实际应用中，样本的运行可能需要不只一个温度条件。 ２．２ ＤｔｔＰＬＣ筛查基冈突变的主要影响凶素 ２．２．１ ＰＣＲ引物的设计 虽然ＤＨＰＩ Ｃ可以检测出１．５ ｋｂ长 的片段内的单个碱基变异，但ＤＨＰＩ Ｃ对于长度为１５０ ｂｐ～６００ ｂｐ的片段检测最为灵敏。因此，，设计ＰＣＲ引物以得到只有一 个溶解区域的片段，避免多个溶解区域非常重要。应该尽可能 地将溶解区域温度范同控制在５℃以内，避免带有非模板尾巴 如通用测序引物。一般推荐的引物褪火温度（Ｔｍ）为５６ Ｃ，引 物之间的Ｔｍ差异应该小于１ Ｃ，且引物应该是高纯度的，没有 错配序列。 ２．２．２ ＰＣＲ产物ＤＨＰＩ Ｃ对ＰＣＲ中的引物和试剂虽无特殊 要求，而且也不必对ＰＣＲ产物进行预处理，但是ＰＣＲ扩产物的 忠实性和扩增产量对分析十分重要。要尽量保证ＰＣＲ扩增产 物的忠实性，避免人为引入错配碱基。 ２．２．３ ＤＮＡ聚合酶ＴａｑＤＮＡ聚合酶对ＤＨＰ１ Ｃ分析产生两 种明显的负面影响。一是在ＤＨＰＩ Ｃ图谱的主峰前，形成一个 额外小峰，影响ＤＨＰＩ Ｃ对杂合双链的分辨能力。另一种影响 是难以形成正常的ＤＨＰＩ Ｃ色谱罔，导致检测的失败。具校正 功能的ＤＮＡ聚合酶和ＴａｑｇｏｌｄＤＮＡ聚合酶对ＤＨＩ Ｉ Ｃ几乎不 图谱的形状。温度是影响ＤＨＰＩ Ｃ检测基因突变成功与否的至 关重要的因素。有些ＳＮＰ对温度不敏感，在较宽的温度范围内 （相差８℃左右）都可对其进行有效筛检，但不少文献报道 ＳＮＰｓ分析对温度要求严格，如将检测温度提高２℃后，就可在 ＲＥＴ基冈中发现两个漏检的ＳＮＰｓ。 ２．２．６洗脱梯度的影响 对于突变检测模式分析而言，软件自 动预测的梯度通常都能满足检测的需要。必要时可进行Ｔｉｍｅ ｓｈｉｆｔ等的调整。 ２．２．７ 固定相 目前，有几种不同的分离介质被用于ＤＨＰＬＣ 分析，如美国Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ公司用粒径为２ ｍ的无孔聚苯乙 烯颗粒。惠普公司则使用孔径为３１５ ｍ的硅胶作为分离柱介 质。最近，瓦里安公司开发出多聚物包被的碱性化硅胶柱。 ２．２．８ 流动相 流动相中离子对试剂ＴＥＡＡ的浓度对ＤＨ— ＰＬＣ分析所需温度有显著影响，ＴＥＡＡ的浓度从１００ ｍｍｏｌＰｌ 升高至２００ｍｍｏｌＰＬ，对应的最佳检测温度就要提高４．０℃～ ４．５℃。流动相的ｐＨ值在６～９范同内对检测效果几乎没有任 何影响，但ｐＨ值过高，将会使双链ＤＮＡ完全变性，达不到检测 目的，而ｐＨ值过低，又会干扰ＤＮＡ与ＴＥＡＡ的相互作用，影 响检测效果。 ，２．３ ＤＨＰＬＣ技术临床应用ＤＨＰＩ Ｃ在哺乳动物中被广泛的 用于研究，它检测基因突变的灵敏度据估计有９７ 或更多＿７］。 ＤＨＰＬＣ主要用于检测基因突变和单核苷酸多态性，还可以用 来进行基因分型。该技术不需要制备凝胶，在疾病相关基因突 变检测、基因克隆、法医学亲子鉴定、病原体检测、寡核苷酸分离 纯化等方面提供了有效的技术手段，也为加快人类后基因组计 划研究步伐提供了新的技术保障。目前在全世界范同内得到了 广泛应用。ＤＨＰＬＣ技术曾被用来进行比较ＤＮＡ测序。近年 来大量的报道显示，ＤＨＰＬＣ有着较高的精确性和极好的灵敏 性（９６ ～１００ ）。ＤＨＰＩ Ｃ在那些已知的多形态和大量基因 突变的研究中起着重要的作用 。 ＤＨＰＬＣ被， 泛的用于基因突变的检测工具，但很少被作 为定量工具进行探究。Ｉ ｉｍ等 在ｍｔＤＮＡ突变研究中首先证 实了ＤＨＰＩ Ｃ技术可用于定量分析。例如，肿瘤组织不同于正 常组织（肿瘤细胞常常是非整背性且周 被正常组织包绕）这种 肿瘤组织样本的获得可能同时包括野生型和突变型ＤＮＡ。位 于这种组织的突变检测更有益于肿瘤的基 鉴定。应用ＤＨ— ＰＩ Ｃ技术调查了异源双链体峰区和异质性水平之间的关系，发 现峰区和基因突变负荷之间是抛物线而不是直线关系。应用定 量ＤＨＰＩ Ｃ分析方法，可对很多已知突变负荷ＤＮＡ样本的异质 性水平进行测定。但ＤＨＰＬＣ在ＤＮＡ突变中定量分析的应用 目前还没有普及。 遗传异质性是很多复杂疾病的特点，而ＤＨＰＩ Ｃ技术因其 中西医结合心脑血管病杂志２００８年Ｈ月第６卷第１１期 １３４３ ｎｅｓ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌ０ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ａｎｄ ｄｅｎａｔｕ— 准确性高和敏感性强，是筛查遗传异质性疾病相关基因突变的 理想方法。这在对腓骨肌萎缩症（ＣＭＴ）和Ｗｉｌｓｏｎ病相关基因 突变的研究中得到了很好的体现。近年来，人们应用ＤＨＰＬＣ 技术对一些重要的遗传病开展了基因诊断或突变筛查，包括常 ｒｉｎｇ ｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＤＨＰ１ Ｃ）［Ｊ］．Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００２，５０（５）：６４９—６５５． ｌｏ Ａ，Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｅ，Ｂｒｉｎｄｌｅ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｃｒｏ—ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ［５］ Ｇａｌ染色体显性或隐性遗传病、Ｘ染色体连锁遗传病、线粒体疾病 等。对于某些多表型疾病，如感觉神经性耳聋、色素性视网膜炎 和外周神经疾病等，都有大量的疾病相关基因突变位点， ＤＨＰＬＣ技术也不失为一种理想的高通量基因突变筛查方法。 还有人应用ＤＨＰＬＣ技术对一些常见的复杂疾病开展了相关基 ｍＲＮＡｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＤＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２００２，３Ｏ（１８）：３９４５—３９５３． ６ Ｐ，Ｋｉｍ Ａ・Ｋｈｒａｐｋｏ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｐｅｅ— ［６］ Ａｎｄｒｔｒｕｍ ｏｆ Ｐｌｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｉａｓｅ ｏｎ ａ ｈｕｍａｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ・ｓｅ—－ ｑｕｅｎｃｅ［Ｊ７．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１９９７，７（８）：８４３—８５２． ｌｉｓ ＬＡ，Ｔａｙｌｏｒ ＣＦ，Ｔａｙｌｏｒ ＧＲ．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＳＳ ［７］ Ｅｌ因筛查，如精神分裂症、２型糖尿病、早老性痴呆症等。尤其是 一些增加精神分裂症和抑郁症等疾病发病风险的相关突变基 因，应用ＤＨＰＬＣ技术可望加速其筛查 ］。 ２．４ ＤＨＰＩ Ｃ技术的优缺点ＤＨＰＬＣ的应用使异源双链 ＤＮＡ的检测变得更加简单、快速，并可自动化操作。ＤＨＰＬＣ 主要的优势在于其自动化的仪器、快速的分析（每个样本约６ ｍｉｎ）、低廉的价格、高通量，并且根据最近的调查显示，其检测基 因突变的精确度在９２．５ ～１００．０ 【 。 。。与传统的杂合双链 分析技术相比较，该技术不需使用放射性同位素，自动化程度 高，样本只需１次循环反应，ＰＣＲ产物直接进行分析，无需染料 标记、纯化等繁琐步骤，９６孑Ｌ样品板自动上样。且该技术成本 比直接测序的成本大约降低了１Ｏ倍左右，有利于在临床上进行 广泛的推广应用。同时还可以分析异质性样本、进行混合样品 的分离检测。 最近的研究报道，ＤＨＰＬＣ与ＤＮＡ测序相比，前者的灵敏 度为１００ ，其特异性在９８ 以上＿１。］。同其他突变检测方法一 样，包括基因测序，ＤＨＰＩ Ｃ也有其局限性＿ｌ ’“］。它可能检测不 到位于片段末端的突变。为了克服这种可能性，引物应该位于 兴趣基因的区域之外。有研究已经成功的鉴定了１６种跨越外 显子１，２和３的突变［１６＿。 ＤＨＰＬＣ检测技术在基因突变的研究中的应用越来越广 泛。尽管直接测序仍是检测基因突变的金标准。ＤＨＰＬＣ凭借 着其高通量、快速、自动化、廉价、准确度高等无可比拟的优势， 将会比直接测序等检测方法在Ｉ临床工作中更加实用。使得基因 突变的筛查更加大众化，这将进一步加速分子生物学研究的进 展，为人类认识和治疗遗传病、肿瘤等疾病提供新的手段。 参考文献： ［１］Ｆａｓａｎｏ Ｔ，Ｂｏｃｃｈｉ Ｉ 。Ｐｉｓｃｉｏｔｔａ Ｉ ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍ ａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＢＣＡ１ ｇｅｎｅ ｍｕｔａ— ｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ＨＤＩ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ［Ｊ］．ｊ Ｉ．ｉｐｉｄ Ｒｅｓ，２００５，４６（４）：８１７— ８２２． ［２］Ｏｅｆｎｅｒ ＰＪ，Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ＰＡ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｄｅｎａｔｕ— ｒｉｎｇ ｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＤＨＰＩ ｃ）［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，１ ９９５．５７（Ｓｕｐｐ１）：Ａ２６６ ［３］Ｔｉｌｌ ＢＪ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＳＨ，Ｗｅｉｌ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＴＩＩ Ｉ ＩＮＧＥＪ］．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ，２００４， ４（Ｉ２）：１４７ｌ一２２２９． ［４］Ｈａｎｎａｃｈｉ—Ｍ Ｚａｌｉ Ｆ，Ａｍｂｌｅｒ ＪＥ．Ｔａｙｌｏｒ ＣＦ，ｅｔ ａ１．Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｈｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｑｕｉｎｏｌｏ． ＣＰ ａｎｄ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＨＰＩ Ｃ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ［Ｊ］．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２０００，１５（６）：５５６—５６４． ］ Ｌｉｍ ＫＳ，Ｎａｖｉａｕｘ ＲＫ，Ｈａａｓ Ｒ Ｈ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｉｔ０ｃｈ０ｎｄ ｒｉａｌ ＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｔｔＰＩ Ｃ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００７，５３ （６）：１０４６—１Ｏ５２． ［９］ Ｌｉｌｌｅｂｅｒｇ Ｓ１ ．Ｉｎ—ｄｅｐｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ＳＮＰ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒｉｓｉｎｇ ＤＨ— ＰＬＣ ｇｅｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ，２００３，６（２）： ２３７—２５２． ［１Ｏ］ Ｇｒｏｓｓ Ｅ，Ａｍｏｌｄ Ｎ，Ｇｏｅｔｔｅ Ｊ，ｅｌ ａ ．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＢＲＣＡｉ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＳＳＣＰ ａｎｄ ＤＨＰＬＣ［Ｊ］． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，１９９９，１０５（１—２）：７２—７８． ［１１］ Ｉ ｉｕ Ｗ，Ｓｍｉｔｈ ＤＩ，Ｒｅｅｈｔｚｉｇｅｌ ＫＪ，ｅｌ ａ１．Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍ— ａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＤＨＰＩ Ｃ）ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｎｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９８，２６： １３９６（２６）一１４００． ［１２］ Ｃｌｅｒｍｏｎｔ Ｏ，Ｂｕｒｌｅｔ Ｐ，Ｂｅｎｉｔ Ｐ，ｅｌ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＭＡ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ＳＭＮ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅ— ｇＹ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＭＮ１ ｓｕｂｔｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ， ２００４，２４（５）：４１７—４２７． ［１３］ Ｂａｇａｔｔｉｎ Ａ，Ｖｅｒｏｎｅｓｅ Ｃ，Ｂａｕｃｅ Ｂ．Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＨＰＩ Ｃ—ｂａｓｅｄ ａｐ— ｐｒｏａｅｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＲＹＲ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｒ— ｒｈｙｔｈｍｉａｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００４，５０（７）：１１４８一ｌ１５５． ［１４］ Ｈｕｍｍａ ＬＭ，Ｆａｒｍｅｒｉｅ ＷＧ，Ｗａｌｌａｃｅ ＭＲ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｂｅ— ｔａ ２——ａｄｒｅｎｏｅｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｔａｑ ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａ— ｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎａｃｃｕｒａｔｅ ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｂ２一 ａｄｒｅｎｏ——ｅｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｔａｑ ＢｉｇＤｙｅＴＭ ｔｅｒｍｉ— —ｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎａｃｃｕｒａｔｅ ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ— ｎｉｑｕｅｓ，２０００，２９（５）：９６２—９６４． ［１５］ Ｎａｅｖｅ ＣＷ，Ｂｕｃｋ ＧＡ，Ｎｉｅｃｅ ＲＬ，ｅｔ ａ１．Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ａ ｍｕｌｔｉ—ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９５，１９（３）：４４８—４５３． ［１６］ Ｏｒｌｏｗ Ｉ，Ｒｏｙ Ｐ，Ｂａｒｚ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｐｅｒ— ｆｏｒｍａｎｅｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｓ ａ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩＮＫ ４ Ａ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ，２００１，３（４）：１５８—１６３． 作者简介：杨文明，主任医师，教授，医学博士，现工作于安徽中医学院第 一附属医院（邮编：２３００００）；李瑞娟，现为安徽中医学院中西医结合ｌ临 床硕士研究生；鲍远程、汪瀚、汪美霞，工作于安徽中医学院第一附属医 院。 （收稿日期：２００８—０８—１３） （本文编辑王雅洁）
