丙二醛含量测定

实验六、植物组织丙二醛含量测定

叶片衰老过程中叶绿素和核酸的降解、叶绿素含量的降低等一系列生理生化变化。这些指标在一定程度上反映了衰老过程的变化。近年来，大量研究表明，在应激或衰老过程中，细胞内活性氧代谢平衡被破坏，有利于活性氧的积累。活性氧积累的危害之一是引起或加剧膜脂过氧化，导致细胞膜系统受损，严重时会导致植物细胞死亡。活性氧包括含氧自由基。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体产生的活性氧主要包括超氧自由基（O-2）、羟基自由基（OH）、过氧自由基（roo）、烷氧基（RO）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（O21）等。植物对活性氧有两种防御系统：酶和非酶。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶过氧化物酶（pod）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA pod）是酶防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（ASA）和还原型谷胱甘肽（GSH）是非酶防御系统中重要的抗氧化剂。

丙二醛(mda)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。[原理]

在酸性条件下加热时，植物组织中的丙二醛（MDA）会与硫代巴比妥酸（TBA）发生显色反应。反应产物为粉红色3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮。该物质在539 nm处有一个吸收峰。由于硫磺

代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm下的吸光度，利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。[材料、仪器、药品]

1.材料：植物抗逆性鉴定试验中的四个菠菜样品，即绿、黄叶高温处理和室温对照。

2．仪器：(1)分光光度计；(2)离心机；（3）水浴锅：(4)天平；(5)研钵；(6)剪刀；(7)5ml刻度离心管；(9)刻度试管(10ml)；(10)镊子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。3．药品：

（1） 0.05mol/lph7。8磷酸钠缓冲液；（2） 石英砂；

(3)5％三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；

（4） 0.5%硫代巴比妥酸溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100ml，即0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液。[方法]

1．丙二醛的提取：取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol/lph7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管

最后，用缓冲液稀释至5ml。以4500 rpm离心10分钟。上清液为丙二醛提取物。

2．丙二醛含量测定：吸取2ml的提取液于刻度试管中，加入0.5％硫代巴比妥酸的

5%三氯乙酸溶液3ml，于沸水浴上加热10min，迅速冷却。于4500转/min离心10min。取上清液于532、600nm波长下，以蒸馏水为空白调透光率100%，测定吸光度。3．结果计算：

（a532－a600）×v1×V丙二醛含量（nmol/g）=1.55×10-1×w×v2

式中：a为吸光度；v1为反应液总量(5m1)；v为提取液总量(5ml)；v2为反应液中的提取液数量(2ml)；w为植物样品重量(0.5g)；1.55×10-1为丙二醛的微摩尔吸光系数（在1升溶液中含有1μmol丙二醛时的吸光度）。4．注意事项：

（1） 0.1～0.5%的三氯乙酸适合于mda-tba反应。如果高于该浓度，则反应溶液的非特异性吸收较高；

(2)mda―tba显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10~15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；

（3） 如果用丙二醛作为植物衰老的指标，首先要测试被测物质的提取物是否能与TBA反应，在532nm处形成吸收峰。否则，仅在532和600nm处测量了两个a值，计算结果与实际情况不一致。测量的高a值是一种错觉；（4） 在糖的干扰下（如深度老化），吸光度的增加将不再存在

是由于脂质过氧化产物mda含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改变了提取液成分，不能再用532nm、600nm两处a值计算mda含量，可测定510、532、560nm处的a值，用a532一(a510―a560)/2的值来代表丙二醛与tba反应液的吸光值。

[实验结果记录][实验前思考题]

（1） 丙二醛含量的测定可以解决哪些理论和实践问题？（2） 植物什么时候会有严重的膜脂过氧化？简述了其过氧化过程。

（3）说明膜脂过氧化作用的对植物的效应。（4）tba为什么要溶解在三氯乙酸中？

（5） 为什么要加热提取物和TBA的混合物？为什么加热时间不能太长？

（6）为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？

（7） 在计算公式中，为什么吸收系数单位为微摩尔，最终含量单位为纳摩尔？

（8）写出实验时间按排和操作流程图。

（9） 编写抗逆性鉴定和丙二醛含量测定实验的统一时间安排和操作流程图。[实验后思考]

（1）如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？

（2） 为什么丙二醛反应溶液加热时间过长而影响测定结果？