克雷伯氏菌固定化技术发酵生产1,3-丙二醇

任良栋;王瑞明;马春玲;黎丽

【摘 要】1,3-propanediol fermentation by immobilized Klebsiella pneumonia was studied. The calcium alginate was found that it has great advantages in the microcapsules preparation and 1,3-propanediol productivity by the com- parison study of four kinds of common embedding materials. The optimum conditions of calcium alginate encapsulation were sodium alginate of 6% (w/v) , calcium chloride of 4% (w/v) , crosslinking time of 4 h. The concentration of I, 3-propanediol in the broth increased by 7.4% compared with free fermentation, and the productivity of 1,3-propane- diol reached 1.04 g/(L · h). Moreover, the immobilized Klebsiella pneumoniae can be used for semi continuous 1,3- propanediol fermentation.%通过对4种常见的包埋材料固定化克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的研究发现,海藻酸钙固定化无论在制备难易还是在发酵强度上都有很大优势,并进一步确定了海藻酸钙固定化的最优条件：海藻酸钠质量浓度6%,CaCl2质量浓度4%,交联时间4 h。相对于游离发酵,固定化发酵1,3-丙二醇终浓度提高了7.4%,发酵强度达到了1.04 g/（L.h）。此外,固定化克雷伯氏菌还能用于1,3-丙二醇半连续发酵。 【期刊名称】《食品与发酵工业》 【年(卷),期】2012(038)011 【总页数】4页(P32-35)

【关键词】海藻酸钙;固定化;克雷伯氏菌;1,3-丙二醇 【作 者】任良栋;王瑞明;马春玲;黎丽

【作者单位】山东轻工业学院食品与生物工程学院山东省微生物工程重点实验室,山东济南250353;山东轻工业学院食品与生物工程学院山东省微生物工程重点实验室,山东济南250353;山东轻工业学院食品与生物工程学院山东省微生物工程重点实验室,山东济南250353;山东轻工业学院食品与生物工程学院山东省微生物工程重点实验室,山东济南250353 【正文语种】中 文 【中图分类】TQ658

1，3 -丙二醇(1，3-propanediol，简称 1，3-PD)被广泛应用于印染、涂料、油墨、药物、抗冻剂、润滑剂等领域，尤其作为生产新型聚酯材料PTT(聚对苯二甲酸丙二醇酯)的单体受到广泛关注［1］。1，3-丙二醇的生产方法主要有化学合成和微生物发酵法，由于石化资源的短缺，近年来微生物发酵法成为国内外研究的热点。

与传统的游离细胞发酵相比，固定化发酵有利于细胞的重复使用，可以节省细胞的培养时间;缓解产物对细胞的反馈抑制［2］;同时由于将微生物固定于一定载体内，细胞不易随发酵液流失，还可以有效提高罐内细胞浓度，提高发酵效率。此外克雷伯氏菌是兼性厌氧菌，在厌氧条件下生成1，3-丙二醇，可以采用固定化方法发酵生产1，3-丙二醇，目前关于这一方面的研究报道并不多见［3－4］。本文通过对海藻酸钙、壳聚糖、琼脂、明胶为包埋材料固定化克雷伯氏菌进行发酵研究，确定了采用海藻酸钙作为包埋材料，并且优化了固定化条件。通过和游离发酵相比较，

固定化发酵在产物浓度和发酵强度上都有很大优势，为以后的工业化道路提供了理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种

实验所用菌种Klebsiella pneumonia 2－1，本实验室筛选保藏。 1.1.2 主要试剂

海藻酸钠、甘油、CaCl2等均为市售化学纯或分析纯。 1.1.3 培养基

种子培养基:甘油 20.0 g;KH2PO41.3 g;K2HPO43.4 g;(NH4)2SO42

g;MgSO4·7H2O 0.2 g;FeSO4·7H2O 5 × 10－3g;CaCl22 × 10－3g;柠檬酸0.42 g;酵母浸膏1.0 g;微量元素溶液A 2 mL;蒸馏水1 000 mL。

发酵培养基:甘油50.0 g;KCl 0.75 g;NaH2PO4 1.38 g;(NH4)2SO46.6

g;Na2SO40.28 g;MgCl2·6H2O 0.26 g;CaCl2·2H2O 0.29 g;柠檬酸0.42 g;酵母浸膏1.0 g;微量元素溶液B 5 mL;蒸馏水1 000 mL。

微量元素溶液 A:ZnCl20.07 g;MnCl2·4H2O 0.1 g;H3BO30.06 g;CoCl2·6H2O 0.2 g;CuCl2·2H2O 0.02 g;NiCl2·6H2O 0.025 g;Na2MoO4·2H2O 0.035 g;蒸馏水1 000 mL。

微量元素溶液B:MnCl2·4H2O 2.0 g;CoCl2·6H2O 0.47 g;H3BO30.06 g;CuCl2·2H2O 0.17 g;FeCl3·6H2O 5.4 g;Na2MoO4·2H2O 0.005 g;ZnCl2·6H2O 0.68 g;蒸馏水 1 000 mL［5］。 1.2 实验方法 1.2.1 种子培养

挑取4℃斜面保存的菌种，接种到装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，

180 r/min好氧培养12 h。 1.2.2 固定化克雷伯氏菌的制备 1.2.2.1 明胶固定

将配制好的20%(质量浓度，下同)的明胶加热融化，冷却至室温后与培养至对数期的种子液按1∶1的体积比混合均匀，倒入无菌平板中，放入4℃冰箱等冷却后用手术刀切成3 mm×3 mm×3 mm小块，浸入0.5%戊二醛溶液中，4℃下交联2 h，用无菌水洗涤3次，备用。 1.2.2.2 琼脂固定

将灭好菌冷却至50℃的6%(质量浓度，下同)的琼脂，与种子液按1∶1体积比混合均匀，同上切成小块(不用戊二醛交联)后备用。 1.2.2.3 海藻酸钙固定

将培养至对数期的种子液与质量浓度6%的海藻酸钠按1∶1体积比混合均匀，用注射器注入4%CaCl2水溶液中，制备成2～3 mm的凝胶颗粒，然后4℃固化4 h，用生理盐水将固定化凝胶颗粒洗3次，洗净备用。 1.2.2.4 聚乙烯醇(PVA)固定

12%(质量浓度，下同)的聚乙烯醇加热融化后冷却，与培养至对数期的种子液按1∶1混合均匀，以注射器注入含有4%硼酸和0.5%CaCl2的水溶液中，制成2～3 mm的凝胶颗粒，4℃固化4 h，用生理盐水将固定化凝胶颗粒洗3次，洗净备用。 1.2.3 游离发酵实验

种子液按10%接种量接入装有200 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，37℃，160 r/min摇床培养，报纸封口保持微氧条件，培养基中添加1%CaCO3调节pH值。

1.2.4 固定化发酵实验

将得到的固定化颗粒按10%的接种量接入含200 mL发酵培养基的250 mL三角

瓶中，发酵条件同游离发酵。 1.2.5 固定化半连续发酵

固定化批次发酵结束后，将发酵液静置5 min，待固定化颗粒沉下后，将上清液倾倒出，用无菌蒸馏水清洗颗粒，然后补加200 mL的新鲜发酵培养基，继续发酵，每隔24 h重复1次，测定结果。 1.3 分析方法 1.3.1 生物量测定

分光光度法:以蒸馏水为空白，测定菌悬液在650 nm下的吸光值，其中固定化发酵生物量用上清液吸光值表示。 1.3.2 1，3-PD测定方法

气相色谱法［6］，色谱条件如下:

色谱柱:填充柱，长2 m，内径3 mm，固定相GDX－401。 检测器:氢火焰离子化检测器(FID)。

色谱条件:载气为氮气，柱温200℃、汽化室温度250℃、检测器温度230℃;空气流量40 kPa，氢气流量60 kPa，氮气流量100 kPa;进样量为1 μL。 定量方法:外标定量法。 1.3.3 甘油测定方法

甘油含量测定采用改进的高碘酸氧化滴定法［7］。 1.3.4 机械强度测定方法

用挤压法［8］近似表示颗粒机械强度。 2 结果与分析

2.1 不同固定化方法的比较

采用明胶、琼脂、海藻酸钙和聚乙烯醇4种常用的固定化材料包埋克雷伯氏菌，经包埋固定化后，按10%的接种量接入发酵培养基，初始甘油浓度50 g/L，37℃，

160 r/min，摇床发酵 24 h，比较不同固定化方法的发酵性能，发酵结果和固定化性能见表1。

表1 不同固定化材料的综合性能比较1.89 1.36 0.79 0.98残余甘油浓度/(g·L－1)2.8 5.4 3.7 7.4 1，3-PD 终浓度/(g·L－1)24.5 22.1 23.8 20.8发酵强度［g·(L·h)－1］1.02 0.92 0.99 0.87固定化难易 容易 容易 较易 较难机械强度 差 较差 强 较强固定化材料 明胶 琼脂 海藻酸钙 聚乙烯醇生物量成本 较贵 低廉 低廉 低廉 由表1可以看出，选择的固定化材料不同，固定化的发酵性能也不同，其中明胶包埋法发酵强度最高，但固定化强度太差，发酵液中游离的菌体量最大，不适合固定化颗粒的重复使用;琼脂包埋法也存在固定化强度太差的缺点;就固定化强度而言，海藻酸钙和聚乙烯醇这2种包埋材料最好，但由于聚乙烯醇黏度条太高，存在固定化操作困难的缺点。综合考虑，海藻酸钙固定化法有发酵性能好，固定化操作容易，颗粒机械强度高，对微生物无毒和成本低廉等优点。基于海藻酸钙的这些优点，在下一步实验中重点研究海藻酸钙固定化发酵条件。 2.2 固定化条件的优化

2.2.1 海藻酸钠浓度对产量的影响

保持种子液∶海藻酸钠=1 1(体积比)、CaCl2浓度4%，固定化时间4 h恒定，改变海藻酸钠浓度，发酵24 h后，固定化 Klebsiella pneumoniae产 1，3-丙二醇的发酵结果如图1所示。

从图1可以看出，不同海藻酸钠浓度对固定化效果的影响不大，但是海藻酸钠浓度过低会影响固定化的强度而且菌体易从微胶囊中流出，不利于固定化颗粒的重复使用;相反，如果海藻酸钠浓度过高，会增加固定化的难度并且影响传质效果。因此，本实验选择6%的海藻酸钠浓度。 图1 海藻酸钠浓度对产1，3-PD的影响 2.2.2 CaCl2浓度对产量的影响

维持种子液∶海藻酸钠=1∶1(体积比)，海藻酸钠浓度6%，固定化时间4 h不变，考察不同CaCl2浓度对固定化效果的影响，结果如图2所示。 图2 CaCl2浓度对产1，3-PD的影响

从图2可以看出，CaCl2浓度对发酵结果有一定影响，随着CaCl2浓度的增加，固定化颗粒的强度越来越大，但当 CaCl2浓度过大(5%)时，1，3-PD的发酵强度有降低的趋势。表明Ca2+浓度是决定固定化颗粒机械强度的重要因素，过高的CaCl2浓度会使过多的Ca2+布满颗粒表面，增加了传质的阻力，从而降低了转化率和发酵强度，但过低的CaCl2浓度又会导致颗粒强度太小，包埋不完全，菌体容易流失。当CaCl2浓度为4%时效果最佳。 2.2.3 交联时间的影响

按海藻酸钠浓度6%，和相同体积的种子液混合均匀后滴入4%的CaCl2中固定不同时间，测定1，3-PD浓度。

从图3可以看出，交联反应时间定为4 h比较好，反应时间低于4 h固定化颗粒强度不足，发酵强度也不高;交联时间超过4 h后，随着交联时间的延长，发酵结果变化并不大，颗粒机械强度也没有明显的变化，但却延长了发酵周期，所以交联时间定为4 h。

图3 交联时间对产1，3-PD的影响 2.3 固定化发酵和游离发酵的比较

采用海藻酸钙固定化克雷伯氏菌和游离发酵相比较，每隔3 h取样分析1次，测定体系中残余甘油和1，3-丙二醇浓度。实验结果如图4。 图4 克雷伯氏菌(K.pnecmonfae)游离和固定化发酵曲线

由图4可以看出，在0～12h由于游离发酵的菌体在接种后能更快的适应发酵环境，甘油消耗速率和1，3-丙二醇的生成速率都高于固定化发酵，但在12～24 h固定化发酵的甘油消耗速率和1，3-丙二醇生成速率明显又高于游离发酵，说明微胶囊

化细胞逐渐适应了生长环境，并且比游离菌体有更高的生物活性。固定化发酵最终的1，3-丙二醇浓度为24.48 g/L，大于游离发酵的22.79 g/L，并且固定化发酵对后期少量残余的甘油也有很好的降解作用，相比于游离发酵最终的残余甘油浓度4.34 g/L，固定化发酵残余甘油只有0.89 g/L，有利于后期分离纯化，这和苏建英［9］的研究结果相似。此外，固定化发酵后微胶囊还有很高的机械强度，可以反复使用。

2.4 固定化半连续发酵工艺

将固定化发酵和补料发酵工艺结合起来，建立了半连续发酵工艺，即固定化发酵到一定时间，将上清液倒出，补入等体积新鲜培养基继续发酵的工艺。考察固定化稳定性和发酵效果。本次共发酵6批次，发酵结果见表2。

表2 各批次发酵综合比较发酵批次A650nm机械强度1 0.650 2.89 22.42 0.93吸光值残余甘油浓度/(g·L－1)1，3-PD浓度/(g·L－1)最大发酵强度/［g·(L·h)－1］强2 0.479 1.53 23.23 0.97 强3 0.455 1.76 23.98 1.00 较强4 0.499 2.27 24.85 1.04 较强5 0.763 2.83 23.19 0.97 较弱6 0.864 2.68 22.98 0.96弱

结果表明，在前4批次发酵中1，3-丙二醇的终浓度不断增加，并且甘油残余量少于90%所需时间分别为 15 h、10 h、9 h、9 h，表明随着批次发酵的进行，微胶囊中所含菌体的数量在逐渐增大，致使底物的消耗速率加快，同时1，3-丙二醇的生成速率增加，发酵强度增大。在5、6批次微胶囊的机械强度开始下降，菌体易流出，胶囊所包含菌体数量逐渐减少，细胞损失较大，可能是发酵液中单价阳离子和磷酸盐对海藻酸钙凝胶结构产生了破坏。但海藻酸钙固定化发酵依然具有很大的优势，可以节约很多种子培养所需要的时间，提高发酵强度，减轻分离纯化的难度等，具有很大工业化潜力。 3 结论

通过对4种常见包埋材料固定化克雷伯氏菌发酵1，3-丙二醇的综合性能比较，选

择海藻酸钙包埋固定化发酵。并且通过对固定化菌体发酵性能的研究，确定了较优的固定化条件:海藻酸钠浓度6%，CaCl2浓度4%，交联时间4h。在此条件下，固定化发酵相比游离发酵，1，3-丙二醇的最大浓度提高了7.4%，生产强度也达到了1.04 g/(L·h)。此外，研究还发现固定化发酵有利于降解培养基中低浓度的甘油，对后期的分离纯化非常有利。此外通过对固定化发酵的半连续培养，表明固定化菌体可以重复使用，为以后的工业生产提供了依据。 参考文献

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