黄酮的提取方案

黄酮提取实验⽅案1材料与仪器1.1 材料1.2 试剂

芦丁，⽆⽔⼄醇，氢氧化钠,⽯油醚，硝酸铝，三氯化铁，三氯化铝，浓氨⽔，浓盐酸，镁粉，亚硝酸钠（以上均为国产分析纯），实验所⽤⽔均为蒸馏⽔。1.3 实验仪器电热恒温⽔浴锅

电⼦天平（感量0.0001g）722型光栅分光光度计索⽒提取器

量筒（100ml,10ml）25ml⽐⾊管移液管⼩试管⽩瓷板圆底烧瓶 100m容量瓶锥形瓶2 实验原理2.1 提取原理

2.2 分离⽅法及原理

3 实验部分3.1原料的预处理

⾦星科厥类叶→除杂→⽔洗→晾⼲→粉碎

3.2 芦丁—标准溶液的配制

将芦丁在⼲燥箱⾥⽤120℃条件下恒重1.5h,然后精确称取芦丁标准品0.01g⽤85%的⼄醇溶液配制成100.00mL的溶液，备⽤。3.3 测定波长的选择

精确移取芦丁标准溶液0.50mL,置于25.00mL的⽐⾊管中，⽤质量分数为85%的⼄醇稀释到10.00mL处，加⼈5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加⼊10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加⼊4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min,加⼊85%的⼄醇溶液⾄刻度，摇匀，10min后在460～560nm处测定吸光度,[4]（以试剂样品做空⽩）选择最⼤吸收波长。

3.4 芦丁标准曲线的绘制

精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于6⽀25.00mL的⽐⾊管中，⽤质量分数为85%的⼄醇稀释到10.00mL处，加⼈5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加⼊10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加⼊4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min，加⼊85%的⼄醇溶液⾄刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度，（以第⼀瓶为空⽩溶液）然后以吸光度和芦丁溶液浓度做图，绘制标准曲线。3.5 黄酮类化合物的特征性实验[5]-[6]

在⼀定条件下对提取的黄酮类化合物进⾏特征性实验，具体容如下：

（1）盐酸—镁粉反应：取1.00mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加⼊浓盐酸数滴（1次加⼊），观察其泡沫颜⾊。（2）三氯化铝反应：取提取液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝⼄醇溶液，吹⼲，观察颜⾊变化。（3）三氯化铁反应：取⼏滴提取液于⽩瓷板上，滴加1%三氯化铁⼄醇溶液，观察其颜⾊。（4）浓氨⽔反应：取⼄醇提取液点在滤纸上，将滤纸在浓氨⽔上⽅熏0.5min，观察其颜⾊变化。3.6 单因素实验

2.6.1 较佳提取剂质量分数的确定

准确称取3g处理好的⾦星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别⽤⽆⽔⼄醇、95%、85% 80%、75% 的⼄醇60mL对3g⾦星厥科叶样品在⽔浴温度为80℃下回流提取3h.提取完毕，⽤与提取剂的质量分数相同的⼄醇反复洗涤圆底烧瓶、滤纸包，将其定容于100:00mL容量瓶中，然后精确吸取0.50mL提取液置于25.00mL的⽐⾊管中，⽤与提取剂质量分数相同的⼄醇稀释到10.00mL处，加⼈5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加⼊10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加⼊4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min,加⼊85%的⼄醇溶液⾄刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定其吸光度，同时做三组平⾏实验。

2.6.2 较佳提取时间的确定

准确称取3g 处理好的⾦星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别⽤2h 、2.5h 、3h 、3.5h 提取时

间⽤60mL 、85%的⼄醇对3g ⾦星厥科叶样品在⽔浴温度为80℃下回流提取，⼄醇提取液的处理⽅法如前，测定其吸光度，同时做三组平⾏实验。2.6.3 较佳提取温度的确定

称取3g 处理好的⾦星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在75℃、 80℃、85℃、 90℃的⽔

浴温度下⽤60mL 、85%的⼄醇对3g ⾦星厥科叶样品回流提取2.5h ，⼄醇提取液的处理⽅法如前，测定其吸光度，同时做三组平⾏实验。

2.6.4较佳物料⽐的确定

称取3g 处理好的⾦星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别⽤30mL 、45mL 、60mL 、75mL 、90mL

的85%的⼄醇溶液在⽔浴温度为85℃下对3g ⾦星厥科叶样品回流提取2.5h ，⼄醇提取液的处理⽅法如前，测定其吸光度，同时做三组平⾏实验。

3.7 叶绿素对黄酮类物质的影响

称取15g ⾦星厥科叶样品放于锥形瓶中⽤90mL 的⽯油醚浸泡8个⼩时对其脱⾊，过滤、⼲燥。然后准确称取处理过的3g ⾦星厥科叶样品⽤质量分数为85%的60mL ⼄醇溶液在⽔浴温度为85℃下对其回流提取2.5h ，⼄醇提取液的处理⽅法如前，测定其吸光度，同时做三组平⾏实验。

3.8 ⾦星厥科叶中黄酮类化合物含量的测定

精密量取⽯油醚处理过的提取液0.50mL ，置于25.00mL 的⽐⾊管中。加85%的⼄醇稀释到

10.00mL,加⼊5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加⼊10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加⼊4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min ，加⼊85%的⼄醇溶液⾄刻度，摇匀，10min 后于波长500nm 处测定吸光度。同时做样品空⽩管.根据标准曲线计算提取物中黄酮类化合物的含量.(把样品所测得吸光度的

平均值代⼊标准曲线⽅程,再算出0.50mL 提取液中黄酮类化合物的浓度,然后再根据浓度算出样品中黄酮类化合物的百分含量.)计算⽅法(公式)如下：

设样品中黄酮类化合物的含量为 ,稀释以后的浓度为C;原提取液的浓度为C0 ;4 结果与讨论

4.1 最⼤吸收波长的选择

将定量的黄酮提取液显⾊以后在460～560nm 处测定吸光度,（以试剂样品做空⽩）选择最⼤吸收波长，测定结果如下：%1001000000.3100?=??g mlCo x VoV C Co ?=

表1 波长与吸光度的关系波长(nm)吸光度(A)波长(nm)吸光度(A)

从表1中可以知道当波长在什么时候有最⼤吸收波峰。4.2 芦丁的标准曲线的绘制

精确吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL的芦丁标准溶液稀释、显⾊以后在波长500nm 处测定吸光度（以第⼀瓶为空⽩溶液），以浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，结果如下：表2 芦丁溶液浓度与吸光度的关系

浓度(mg/mL) 0.002 0.004 0.008 0.012 0.016吸光度

实验结果表明黄酮类化合物含量在0～100ug/mL围与吸光度呈良好的线性关系，其回归⽅程为Y=11.5548X-0.00406R=0.99342,

4.3黄酮类化合物的特征性实验

对所提取的黄酮类化合物进⾏特征性实验的结果如下表：表3定性实验结果试剂现象盐酸—镁粉1%三氯化铝1%三氯化铁浓氨⽔

从表3可知，黄酮类化合物的特征性实验结果较符合黄酮类化合物的特征颜⾊反应，证明所提取中含有黄酮类化合物。4.4 单因素实验的结果

4.4.1较佳提取剂质量分数的确定

准确称取3g处理好的⾦星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别⽤⽆⽔⼄醇、95%、85% 80%、75% 的⼄醇60mL对3g⾦星厥科叶样品在⽔浴温度为80℃下回流提取3h.显⾊后测其吸光度，测定结果如下：表4 不同⼄醇质量分数对西⼭中黄酮类物质提取的结果⼄醇的质量分数 (%) ⽆⽔⼄醇 95 85 80 75 吸光度1吸光度2吸光度3平均值

4.4.2 较佳提取时间的确定

准确称取3g处理好的⾦星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别⽤2h、2.5h 、3h 、3.5h提取时间⽤60mL，85%的⼄醇对3g⾦星厥科叶样品在⽔浴温度为80℃下回流提取。显⾊后测其吸光度，测定结果如下：表5 不同提取时间对西⼭中黄酮类物质的提取结果提取时间（h） 2 2.5 3 3.5吸光度1吸光度2吸光度3平均值

4.4.3较佳提取温度的确定

称取3g处理好的⾦星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在75℃、 80℃、85℃、 90℃的⽔浴温度下⽤60mL，85%的⼄醇对3g⾦星厥科叶样品回流提取2.5h。显⾊后测其吸光度，测定结果如下：表6 不同提取温度对西⼭中黄酮类物质的提取结果提取温度（℃） 75 80 85 90吸光度1吸光度2吸光度3平均值

4.4.4较佳物料⽐的确定

称取3g处理好的⾦星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别⽤30mL、45mL 、60mL、75mL 、90mL 质量分数为85%的⼄醇在⽔浴温度为85℃下对3g样品回流提取2.5h。显⾊后测其吸光度，测定结果如下：

表7 不同物料⽐对⾦星厥科叶中黄酮类物质的提取结果物料⽐（w/v） 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30吸光度1吸光度2吸光度3平均值

4.5 叶绿素对黄酮类物质含量测定的影响

准确称取⽤⽯油醚脱⾊过的3g⾦星厥科叶样品⽤质量分数为85%的⼄醇60mL在⽔浴温度为85℃下对其回流提取2.5h，显⾊后测其吸光度，测定结果如下：

表8叶绿素和脂肪对黄酮类物质提取效果的影响

样品⽯油醚浸泡对照样吸光度1吸光度2吸光度3平均值

4.6⾦星厥科叶中黄酮类化合物含量

取黄酮提取液（⽤⽯油醚浸泡过的）0.50mL测定其吸光度并按公式计算其含量，实验结果如下：表9⾦星厥科叶中黄酮类化合物含量

项⽬吸光度(C) 浓度(mg/mL ) 黄酮类化合物含量(%) 标准曲线